Etude structure fonction de l’ultime étape de la voie de sécrétion de type 2 : architecture et dynamique de l’endopilus et de la sécrétine

Structure function study of the last step of the type 2 secretion pathway : Architecture and dynamics of the endopilus and secretin

• Auteur / Autrice : Brice Barbat
• Direction : Romé Voulhoux
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie-Santé - Spécialité Microbiologie
• Date : Soutenance en 2023
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : LCB - Laboratoire de Chimie Bactérienne
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : LCB - Biology of transport systems in Pseudomonas aeruginosa
• Jury : Président / Présidente : Emilia Mauriello
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Romé Voulhoux, Martin Picard, Andréa Dessen, Jean-François Collet, Olivera Francetic
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Jean-François Collet, Olivera Francetic

Mots clés

Mots clés libres

Sécrétine

Endopilus

Système de sécrétion de type 2

Pseudomonas aeruginosa

Dynamique

Sécrétion

Secretin

Endopilus

Type 2 secretion system

Pseudomonas aeruginosa

Dynamic

Secretion

Résumé

Le système de sécrétion de type 2 (SST2) est une nanomachine moléculaire enchâssée dans l’enveloppe des bactéries didermes orchestrant la sécrétion en deux étapes d’enzyme dégradatives et de toxines sous forme repliée. Le SST2 est composé de 3 sous-complexes jouant un rôle précis dans le processus de sécrétion. Ainsi, la plateforme de membrane interne supporte l’assemblage d’une fibre hélicoïdale nommé endopilus. La piline majeure GspG oligomérise pour former le corps de l’endopilus tandis que les pilines mineures GspHIJK forment un complexe quaternaire positionné au sommet. L’endopilus fonctionnerait comme un piston permettant de pousser les protéines à sécréter à travers la sécrétine GspD, un large canal de membrane externe. Afin de comprendre le fonctionnement du SST2, de nombreuses études structurales ont été réalisées offrant ainsi de précieux outils pour explorer la dynamique du système. Mon projet de thèse était focalisé sur la compréhension de la structure et de la dynamique de l’endopilus et de la sécrétine du SST2 Xcp de Pseudomonas aeruginosa. Premièrement, nous avons appliqué une approche de coévolution in silico afin de définir l’interface d’interaction entre la piline XcpH et le complexe formé des trois autres pilines mineures XcpIJK. Combinées aux information obtenues par des approches biophysiques, nous avons élaboré le premier modèle structural complet du complexe quaternaire de pilines mineures XcpHIJK localisé au sommet de l’endopilus. Nous avons validé ce modèle structural à l’aide d’approches de spectroscopie de Résonance Paramagnétique Electronique in vitro et de pontage cystéine in vivo révélant par la même occasion que l’interface XcpH/XcpJ est flexible en l’absence de la piline majeure XcpG. Dans un deuxième temps, nous avons exploité les données structurales disponibles sur la sécrétine XcpD afin de comprendre sa dynamique in vivo lors du processus de sécrétion. Par l’application du pontage cystéine réversible couplé à des tests phénotypiques, nous avons montré que le domaine N-terminal de XcpD nécessite de la flexibilité pour assurer la sécrétion des effecteurs ce qui permettrait la coexistence des deux conformations alternatives observées pour ce domaine. Cet outil nous a également permis de démontrer que la porte cloisonnant la cavité interne de la sécrétine possède une flexibilité cruciale pour son ouverture lors de la sortie des effecteurs repliés et sa fermeture pour maintenir l’étanchéité de la membrane externe. Enfin, en combinant des tests phénotypiques in vivo ainsi que des analyses génomiques et phylogénétiques in silico, nous avons révélé qu’une importante partie des sécrétines connues possèdent une porte apicale facultative qui cloisonne la sortie de la cavité de la sécrétine et augmente significativement son niveau d’étanchéité du canal. L’ensemble des travaux réalisés au cours de ce projet de thèse permettent de mieux comprendre comment l’architecture et la dynamique de l’endopilus et de la sécrétine, les deux acteurs de la scène du « Final Push » du SST2, permettent à ce système de sécrétion singulier de transporter de larges protéines repliées à travers la membrane externe sans altérer l’intégrité cellulaire.

The type 2 secretion system (T2SS) is a molecular nanomachine embedded in the envelope of diderm bacteria, orchestrating the two-step secretion of fully folded degradative enzymes and toxins. T2SS is composed of 3 sub-complexes playing specific roles in the secretion process. The inner membrane platform supports the assembly of a helical fiber called endopilus. The major pilin GspG oligomerizes to form the body of the endopilus, while the minor pilins GspHIJK form a quaternary complex positioned at the top of the fiber. The endopilus would function as a piston to push secreted proteins through the GspD secretin, a large outer membrane channel. In order to understand how T2SS functions, numerous structural studies have been carried out, providing valuable tools for exploring the system's dynamics. My PhD project focused on understanding the structure and dynamics of the endopilus and secretin found in Pseudomonas aeruginosa T2SS Xcp. Firstly, we applied a coevolution approach in silico to define the interaction interface between the minor pilin XcpH and the complex of the three other minor pilins XcpIJK. Combined with information from biophysical approaches, we generated the first complete structural model of the quaternary complex of the four minor pilins at the tip of the endopilus. We validated this structural model using Electron Paramagnetic Resonance spectroscopy in vitro and cysteine crosslinking in vivo, revealing in the process that the XcpH/XcpJ interface is flexible in the absence of the major pilin XcpG. Secondly, we exploited the structural data available for the secretin XcpD to understand its dynamics in vivo during the secretion process. By applying reversible cysteine crosslinking coupled to phenotypic assays, we showed that the N-terminal domain of XcpD requires flexibility to ensure effector secretion, which would allow the coexistence of the two alternative conformations observed for this domain. This tool also allowed us to demonstrate that the gate found in the inner cavity of the secretin requires flexibility essential for its opening during the secretion of folded effectors and for its closing to maintain the tightness of the outer membrane. Finally, by combining in vivo phenotypic tests with in silico genomic and phylogenetic analyses, we revealed that a significant proportion of known secretins possess an accessory apical gate that closed the exit from the secretin cavity and significantly increases the level of channel tightness. Taken together, the work carried out during this PhD project provides a better understanding of how the architecture and dynamics of endopilus and secretin, the two actors of the “Final Push” in the T2SS, enable this singular secretion system to transport large folded proteins across the outer membrane without altering the cell integrity.