Analyses de l'épigénome et du transcriptome des modèles dérivés de Kabuki, impact des epi-drogues sur des profils d'altération des enhancers et du transcriptome

Epigenome and transcriptome analyses of kabuki-derived models, impact of epidrugs on enhancer/transcriptome alteration profiles

• Auteur / Autrice : Pol Arnau-romero
• Direction : Jean-Christophe Andrau, Cyril Esnault
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Inscription en doctorat le 01/11/2023
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : IGMM - Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Transcription et epigénomique dans les cellules T

Mots clés

Mots clés libres

Epigénétique

Enhancers

Kabuki

Epigenetics

Enhancers

Kabuki

Résumé

Contexte et justification Les chromatinopathies sont un groupe de maladies génétiques rares, qui partagent des caractéristiques cliniques ainsi que des altérations génétiques causales, conduisant à l'inactivation des régulateurs de la chromatine impliqués dans le contrôle de l'expression des gènes et l'organisation tridimensionnelle de la chromatine. Le syndrome de Kabuki (KS) est un exemple de chromatinopathie rare dont l'incidence est de 1/30 000 naissances et qui présente de multiples symptômes tels que des anomalies squelettiques, une petite taille, des malformations cardiaques, des troubles de la vision et de l'audition et des anomalies du système immunitaire (1). Au niveau moléculaire, cette maladie est due à des mutations essentielles des gènes Kmt2d et Kdm6a, qui représentent respectivement 75 % et 5 % des cas (2). KMT2D, également connu sous le nom de MLL4, est une mono-méthyltransférase qui agit sur les enhancers, se liant à des régions enhancers spécifiques en fonction du type de cellule et du stade de différenciation. MLL4 intervient dans le dépôt de H3K4me1, qui est une marque d'histone activatrice des enhancers. KDM6A, quant à elle, contient un domaine JmjC et catalyse la déméthylation de H3K27me3 (une marque déposée par le complexe PRC2 et qui est associée aux enhancers inactifs) (3). KMT2D et KDM6A font tous deux partie de la famille de protéines COMPASS (complex of proteins associated with SET1). Par le dépôt de H3K4me1 et la soustraction de H3K27me3 respectivement, ces deux facteurs contribuent à l'activation et/ou à la dérépression des enhancers en place, activant ainsi d'importants programmes d'expression génétique. (3) D'autre part, l'effet de ces médiateurs épigénétiques peut être contrarié par des enzymes qui inactivent les enhancers. Par exemple, LSD1 (KDM1A) intervient dans la déméthylation de K4me1 (4) et PRC2 intervient dans le dépôt de H3K27me3. Il existe donc une hypothèse selon laquelle l'utilisation de médicaments épigénétiques pour l'inactivation de LSD1, en combinaison avec l'inhibition de PRC2, augmenterait H3K4me1 tout en diminuant les marques H3K27me3 (augmentant ainsi les marques d'histones activantes et diminuant les marques d'histones inactivantes au niveau des enhancers), ce qui pourrait représenter un traitement possible pour les chromatinopathies telles que la KS. Objectifs 1- Utiliser et développer des échantillons primaires de patients en utilisant des fibroblastes, des iPS et des lymphocytes T (CD4+) pour étudier les profils épigénomiques, en analysant par CUT&RUN-Sequencing les mutations de Kmt2d, Km6a et d'autres gènes et leurs profils transcriptomiques par RNA-Sequencing. 2- Développer des mutants pour Kmt2d et Km6a par la technologie CRISPR pour imiter les mutations des patients atteints de KS en utilisant des modèles de poisson zèbre. 3- Analyser les changements tridimensionnels et d'accessibilité de la chromatine lors de la mutation de ces auteurs/électeurs épigénétiques par Hi-C / Micro-C (5) (collaboration avec le laboratoire du Dr Pekowska du consortium Chrom_Rare). 4- Contribuer à l'analyse des profils épigénomiques des modèles organoïdes de KS (collaboration avec le groupe de D. Geneviève du consortium Chrom_Rare). 5- Caractériser les propriétés mécaniques nucléaires dans les modèles mutés Kmt2d (collaboration avec le laboratoire du Dr. Zippo du consortium Chrom_Rare). 6- Traiter les cellules dérivées de patients et les cellules de poisson zèbre avec des médicaments épigénétiques tels que les inhibiteurs de LSD1 ou de PRC2 afin d'étudier les changements phénotypiques et moléculaires qui s'ensuivent. Références 1. Stagi, S., Gulino, A. V., Lapi, E. et Rigante, D. (2015). Contrôle épigénétique du système immunitaire : une leçon du syndrome de Kabuki. Immunologic Research, 64(2), 345 359. https://doi.org/10.1007/s12026-015-8707-4 2. Boniel, S., Szymańska, K., Śmigiel, R., & Szczałuba, K. (2021). Syndrome de Kabuki - Revue clinique avec aspects moléculaires. Genes, 12(4), 468. https://doi.org/10.3390/genes12040468 3. Sze, C. C. et Shilatifard, A. (2016). Famille MLL3/MLL4/COMPASS sur la régulation épigénétique de la fonction d'enhancer et le cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine, 6(11), a026427. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a026427 4. Maiques-Diaz, A., & Somervaille, T. C. P. (2016). LSD1 : rôles biologiques et ciblage thérapeutique. Epigenomics, 8(8), 1103 1116. https://doi.org/10.2217/epi-2016-0009 5. Burgess, D. J. (2020). Chromosome structure at micro-scale. Nature Reviews Genetics, 21(6), 337. https://doi.org/10.1038/s41576-020-0243-y

Background and Rationale Chromatinopathies are a group of rare genetic diseases, which share clinical features as well as causal genetic alterations, leading to the inactivation of chromatin regulators involved in gene expression control and 3D chromatin organization. Kabuki syndrome (KS) is an example of rare chromatinopathy with an incidence of 1/30.000 births, which includes multiple symptoms such as skeletal abnormalities, short stature, heart defects, vision and hearing difficulties and immune system abnormalities (1). At the molecular level, this disease is driven by essential mutations in the Kmt2d and Kdm6a genes, which represent 75% and 5% of cases respectively (2). KMT2D, also known as MLL4, is a mono-methyltransferase that acts on enhancers, binding to specific enhancer regions based on cell type and differentiation stage. MLL4 mediates the deposition of H3K4me1, which is an activating histone mark of enhancers. KDM6A on the other hand contains a JmjC-domain and catalyzes the demethylation of H3K27me3 (a mark deposited by the PRC2 complex and that is associated with inactive enhancers) (3). Both KMT2D and KDM6A are part of the COMPASS (complex of proteins associated with SET1) family of proteins. Through H3K4me1 deposition and H3K27me3 subtraction respectively, both these factors contribute to the activation and/or derepression of poised enhancers, activating important genetic expression programs. (3) On the other side, the effect of these epigenetic mediators can be antagonized by enzymes which inactivate enhancers. For example, LSD1 (KDM1A) mediates the demethylation of K4me1 (4) and PRC2 mediates the deposition of H3K27me3. Therefore, a hypothesis arises by which the use of epigenetic drugs for the inactivation of LSD1, in combination with the inhibition of PRC2, would increase H3K4me1 while decreasing H3K27me3 marks (therefore increasing activating and decreasing inactivating histone marks at enhancers), which could represent a possible treatment for chromatinopathies such as KS. Objectives 1- Use and develop primary patient's samples using fibroblasts, iPS and T lymphocytes (CD4+) to investigate epigenomic profiles, by analysing with CUT&RUN-Sequencing mutations in Kmt2d, Km6a and other genes and their transcriptomic profiles by RNA-Sequencing. 2- Develop mutants for Kmt2d and Km6a through CRISPR technology to mimick KS patient mutations using zebrafish models. 3- Analyze chromatin tridimensional and accessibility changes upon mutation in these epigenetic writers/erasers through Hi-C / Micro-C (5) (collaboration with Dr Pekowska lab from the Chrom_Rare consortium). 4- Contribute to the analysis of epigenomic profiles of KS organoid models (collaboration with D. Genevieve's group from the Chrom_Rare consortium). 5- Characterize the nuclear mechanical properties in Kmt2d mutated models (collaboration with Dr. Zippo's lab from the Chrom_Rare consortium). 6- Treat both patient-derived and zebrafish cells with epigenetic drugs such as LSD1 or PRC2 inhibitors to investigate subsequent phenotypic and molecular changes. References 1. Stagi, S., Gulino, A. V., Lapi, E., & Rigante, D. (2015). Epigenetic control of the immune system : a lesson from Kabuki syndrome. Immunologic Research, 64(2), 345 359. https://doi.org/10.1007/s12026-015-8707-4 2. Boniel, S., Szymańska, K., Śmigiel, R., & Szczałuba, K. (2021). Kabuki Syndrome—Clinical review with Molecular Aspects. Genes, 12(4), 468. https://doi.org/10.3390/genes12040468 3. Sze, C. C., & Shilatifard, A. (2016). MLL3/MLL4/COMPASS Family on Epigenetic regulation of enhancer function and cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine, 6(11), a026427. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a026427 4. Maiques-Diaz, A., & Somervaille, T. C. P. (2016). LSD1 : Biologic roles and therapeutic targeting. Epigenomics, 8(8), 1103 1116. https://doi.org/10.2217/epi-2016-0009 5. Burgess, D. J. (2020). Chromosome structure at micro-scale. Nature Reviews Genetics, 21(6), 337. https://doi.org/10.1038/s41576-020-0243-y