Bioconstruction d'un tube biliaire sur puce microfluidique pour la toxicologie et la physiopathologie

Bioconstruction of a bile duct on a microfluidic chip for toxicology and physiopathology

• Auteur / Autrice : Charlotte Neel
• Direction : Pascale Dupuis-williams, Bruno Le Pioufle
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Inscription en doctorat le 30/09/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Signalisations et réseaux intégratifs en biologie (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Physiopathogenèse et traitement des maladies du foie
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Homéostasie biliaire et Réparation du foie
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université Paris-Saclay. Faculté de médecine (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2020-....)

Mots clés

Mots clés libres

Microfluidique

Coextrusion

Toxicologie

Epithelium biliaire

Bioingéniérie

Foie sur puce

Liver on chip

Coextrusion

Bioengineering

Microfluidics

Biliary epithelium

Toxicology

Résumé

Les tubes biliaires, organisés en arborescence, ont pour rôle de récolter et transporter la bile sécrétée par les hépatocytes hors du foie. Les cholangiocytes sont les cellules épithéliales qui tapissent le réseau biliaire ramifié tridimensionnel à l'intérieur et à l'extérieur du foie, dont le rôle principal est de transporter la bile produit par les hépatocytes, du foie vers le duodénum. L'épithélium biliaire, composé de cholangiocytes, protège le parenchyme hépatique de la bile, hautement toxique et la modifie grâce à des transporteurs spécifiques qui régulent son volume et sa composition [1]. Compte- tenu du manque de thérapie efficace, les cholangiopathies sont associées à une morbidité et une mortalité importantes. Les maladies biliaires représentent respectivement 30 et 70% des causes de transplantation adultes et pédiatriques. L'épithélium biliaire est aussi la cible de médicaments courants comme certains antibiotiques [2]. L'absence de modèles in vitro a longtemps été un frein dans l'étude physiopathologique du système biliaire car les cultures 2D de cholangiocytes ne rendent pas compte des propriétés de l'épithélium tubulaire, et plus précisément du flux biliaire, essentiel à l'homéostasie épithéliale [3]. Récemment, le développement de la culture 3D a participé au développement de modèles d'organoïdes biliaires plus ou moins élaborés, mais la tubulogenèse reste élémentaire pour permettre la perfusion de bile nécessaire à l'homéostasie de l'épithélium biliaire [4]. La construction de structures biliaires tubulaires reste un challenge et à ce jour un seul modèle de tube sur puce a été publié [5], [6]. Mais ses petites dimensions, son inclusion dans un gel de collagène ainsi que sa construction avec des cellules murines en restreint beaucoup les applications. L'objectif de cette thèse est de répondre à cette problématique en développant un modèle de tube biliaire pour l'étude sur puce microfluidique de cholangiopathies et de la toxicologie. Cette thèse est un projet collaboratif entre deux équipes. L'équipe P. Dupuis-Williams (laboratoire INSERM-1193) a développé un nouveau protocole de bio-impression de tubes biliaires humains. Les études de reproductibilité, d'architecture épithéliale, de fonctions physiologiques élémentaires a permis de faire la preuve de concept d'un projet de bioingéniérie qui a été financé par l'ANR. L'équipe de B. Le Pioufle et Sakina Bensalem (ENS Paris-Saclay, laboratoire LUMIN) développe des puces microfluidiques permettant de reproduire in vitro l'architecture du canal de Herring (unité constitutive d'un module hépatique). L'étudiant(e) élaborera des tubes biliaires par bio-impression avec co-extrusion. La co-extrusion est obtenue grâce à une « buse » microfluidique permettant de générer un flux laminaire, comprenant le milieu entouré d'une couche alliant les cholangiocytes à un gel, le tout enveloppé par un gel contenant de l'alginate de calcium. Il ou Elle réalisera de nouveaux développements pour intégrer ces tubes biliaires dans un dispositif microfluidique afin d'étudier leurs propriétés mécaniques et biologiques. Le design du dispositif devra prendre en compte les contraintes de la culture cellulaire et à celles de la microfluidique. Les propriétés structurales et physiologiques des tubes biliaires seront étudiées pour optimiser le système. L'analyse de bile perfusée dans les tubes biliaires permettra de valider la fonction de l'organe sur puce ainsi reconstitué. Des tests de toxicité de médicament sont envisagés sur ce système biomimétique. Ce système pourrait également permettre l'intégration de sphéroïdes d'hépatocytes ou de tissus hépatiques micro-structurés afin d'étudier sur puce la formation des voies biliaires.

The biliary tubes, organized in a tree structure, have the role of collecting and transporting the bile secreted by the hepatocytes out of the liver. Cholangiocytes are the epithelial cells that line the 3- dimensional branched biliary network inside and outside the liver, whose primary role is to carry the bile produced by the hepatocytes, out of the liver to the duodenum. Biliary epithelium, made up of cholangiocytes, protects the hepatic parenchyma from highly toxic bile and modifies it through specific transporters that regulate its volume and composition [1]. Given the lack of effective medical therapies, cholangiopathies are associated with substantial morbidity and mortality. Biliary diseases account for 30 and 70% of adult and pediatric liver transplants, respectively. The biliary epithelium is also the target of common drugs such as certain antibiotics [2]. The shortage of in vitro models has long hampered pathophysiological studies of the biliary system because 2D cultures of cholangiocytes do not take into account the properties of the tubular epithelium, and more precisely of the bile flow, essential for epithelial homeostasis [3]. Recently, the development of 3D culture has participated in the development of more or less elaborate biliary organoid models, but tubulogenesis remains imperative to allow the bile perfusion necessary for the homeostasis of the biliary epithelium [4]. Up to now, the construction of tubular structures remains a challenge and only one tube-on-chip model has been published so far [5], [6]. But its small dimensions, its inclusion in a collagen gel as well as its construction with murine cells greatly restrict its uses. The aim of this thesis is to answer to these issues by developing a biliary tube model for cholangiopathy and toxicology studies on a microfluidic chip. This thesis is a collaborative project between two teams. The P. Dupuis-Williams team (INSERM-1193 laboratory) has developed a new protocol for human bile ducts bio-printing. Studies of reproducibility, epithelial architecture and elementary physiological functions have made it possible to demonstrate the proof of concept of a bioengineering project funded by the ANR. B. Le Pioufle's team (ENS Paris-Saclay, LUMIN laboratory) is developing microfluidic chips to reproduce in vitro the architecture of the Herring canal (constituent unit of a hepatic module). The student will develop biliary tubes by bio-printing with co-extrusion. The co-extrusion is obtained thanks to a microfluidic 'nozzle' making it possible to generate a laminar flow comprising the medium surrounded by a gel and cholangiocytes layer, the whole wrapped by a gel containing calcium alginate. The student will carry out new developments to integrate these bile ducts into a microfluidic device in order to study their mechanical and biological properties. The design of this device must take into account the constraints of cell culture and those of microfluidics. The structural and physiological properties of the biliary tubes will be studied to optimize the system. The analysis of bile perfused in the biliary tubes will validate the organ function on a chip. Drug toxicity testing is discussed on this biomimetic system. This system could also allow the integration of isolated hepatocytes or hepatocyte spheroids in order to reconstruct a hepatic span on a chip.