Étude e-PIBO : Étude pilote morphologique et fonctionnelle de l'épithélium bronchique des enfants présentant une bronchiolite oblitérante post infectieuse

e-PIBO: Morphological and functional pilot study of the bronchial epithelium of children with post-infectious bronchiolitis obliterans

• Auteur / Autrice : Julie Mazenq-donadieu
• Direction : Pascal Chanez, Delphine Gras
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie-Santé - Spécialité Immunologie
• Date : Inscription en doctorat le 01/09/2023
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale Sciences de la vie et de la santé (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : C2VN - Centre de Recherche en CardioVasculaire et Nutrition
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : C2VN - E2 - Thrombose, plaquettes et pathologies vasculaires

Mots clés

Mots clés libres

Bronchiolite oblitérante post infectieuse

Épithélium

Culture cellulaire

Morphologie

Adénovirus

Enfants

Post infectious bronchiolitis oblitérant

Epithelium

Cellular culture

Morphology

Adenovirus

Children

Résumé

Mon projet de thèse sera une étude pilote visant à mieux définir : - les atteintes de l'épithélium respiratoire chez des enfants présentant une bronchiolite oblitérante post infectieuse (PIBO) à la suite d'une infection à Adénovirus ou Rhinovirus - le rôle des cellules épithéliales respiratoires dans la PIBO Plan expérimental et résultats attendus • Population et échantillonnage Tous les enfants présentant une infection respiratoire basse à Adénovirus ou Rhinovirus (déterminée par PCR sur écouvillon nasal en collaboration avec le service du Pr De Lamballerie, IHU, Marseille) et nécessitant une hospitalisation au CHU Timone enfant seront inclus sur une période de 3 ans (de septembre 2023 à septembre 2026). Un brossage nasal sera effectué au décours de leur infection. Les cellules épithéliales seront mises en culture et conservées pour les études in vitro subséquentes. Parmi les enfants recrutés, nous suivrons les enfants qui développeront une PIBO définie par des critères : - Cliniques : signes cliniques persistant 6 semaines après une infection virale : tachypnée, respiration sifflante et hypoxémie persistante - Scanographiques : aspect en mosaïque +/- bronchiectasies, atélectasie - +/- EFR si réalisée : trouble ventilatoire obstructif non ou peu réversible après bronchodilatateurs. Un refus de participation à l'étude de la part de la famille ou l'existence d'une pathologie pulmonaire chronique sous-jacente (e.g mucoviscidose, dyskinésie ciliaire) seront un motif de non-inclusion. Au décours du diagnostic de PIBO chez ces enfants, une endoscopie bronchique pour une microbiologie (LBA) et des biopsies bronchiques seront effectuées afin d'éliminer des diagnostics différentiels (anatomopathologie, microscopie électronique). Lors de cette endoscopie, des biopsies bronchiques et un nouveau brossage nasal seront réalisés afin de récupérer les cellules épithéliales pour les études in vitro. Certains enfants présentant une PIBO n'ont qu'une réponse partielle au traitement à 6 mois et bénéficient d'une nouvelle endoscopie bronchique. Lors de cette endoscopie, des biopsies bronchiques et un brossage nasal seront réalisés afin de récupérer les cellules épithéliales pour les études in vitro. • Plan expérimental Tout d'abord, une étude morphologique de l'épithélium nasal des enfants présentant une PIBO versus celui des enfants ne développant pas de PIBO sera réalisée grâce à un modèle d'épithélium reconstitué in vitro en interface air liquide utilisé en routine au laboratoire. La morphologie des épithéliums nasaux et bronchiques des PIBO sera également analysé au cours de l'évolution de la maladie à la fois ex vivo (biopsies fixées et incluses en paraffine) et in vitro. Plusieurs critères seront analysés tels que la composition cellulaire, l'épaisseur et la cohésion épithéliale. Ensuite, grâce au modèle de culture in vitro, une étude fonctionnelle de l'épithélium sera réalisée : - La production de médiateurs pro-inflammatoires, anti-viraux, impliqués dans le remodelage et la transition épithélio-mésenchymateuse ou pouvant être impliqués dans le développement d'une PIBO seront mesurés à l'état de base. - Les épithéliums nasaux PIBO vs non PIBO seront soumis in vitro à une stimulation virale (RVA16 ou ADV) afin de mimer l'exposition initiale au virus et mieux comprendre la réponse différentielle des cellules épithéliales à cette infection. Enfin, grâce à l'utilisation de la technologie de séquençage sur cellules uniques (scRNAseq), le profil transcriptomique des biopsies bronchiques d'enfants présentant une PIBO (n=3) sera également étudié et comparé à des bases de données de biopsies « témoins » (FasteQ, Human cell lung atlas). • Résultats attendus Cette étude pilote permettra l'étude morphologique et fonctionnelle de l'épithélium respiratoire d'enfants développant une PIBO à la fois par des études ex vivo et in vitro. Elle permettra de mieux comprendre l'implication de l'épithélium au cours de l'évolution de la maladie d'une part mais aussi en fonction de sa localisation dans l'arbre respiratoire (nez vs bronche). L'analyse du transcriptome au niveau de la cellule unique permettra de mettre en évidence, pour la 1ère fois, l'hétérogénéité cellulaire et de suivre la dynamique de l'évolution cellulaire au cours de la maladie (PIBO) pouvant servir de base pour des études ultérieures. En parallèle de ce projet, nous menons actuellement une étude de prévalence en France des PIBO sur les 5 dernières années. Faisabilité Le stockage des échantillons et les expériences in vitro se feront au sein du laboratoire de recherche C2VN (équipe émergente du Pr P. Chanez, sous la responsabilité du Dr D.Gras). L'équipe maitrise les techniques de culture et d'analyses de l'épithélium respiratoire ainsi que les méthodes d'infection virale (travail en L2). Pour le scRNAseq, la plateforme « Genomics and Bioinformatics » du MMG à Marseille sera impliquée. Une demande de CPP est en cours pour la réalisation des prélèvements non prévus dans le cadre du diagnostic ou du soin.

My project will be a pilot study aimed at defining: - damage to the respiratory epithelium in children presenting with post infectious bronchiolitis obliterates (PIBO) following an Adenovirus or Rhinovirus infection - the role of respiratory epithelial cells in PIBO Experimental plan and expected results • Population and sampling All children with a lower respiratory infection due to Adenovirus or Rhinovirus (determined by PCR on nasal swab in collaboration with the department of Pr De Lamballerie, IHU, Marseille) and requiring hospitalization at the CHU Timone enfant will be included over a period of 3 years ( from September 2023 to September 2026). A nasal brushing will be carried out during their infection. Epithelial cells will be cultured and stored for subsequent in vitro studies. Among the recruited children, we will follow the children who will develop a PIBO defined by criteria: - Clinical: persistent clinical signs 6 weeks after a viral infection: tachypnea, wheezing and persistent hypoxemia - CT scans: mosaic aspect +/- bronchiectasis, atelectasis - +/- EFR if performed: obstructive ventilatory disorder not or only slightly reversible after bronchodilators. A refusal to participate in the study on the part of the family or the existence of an underlying chronic pulmonary pathology (e.g. cystic fibrosis, ciliary dyskinesia) will be grounds for non-inclusion. Following the diagnosis of PIBO in these children, a bronchial endoscopy for microbiology (LBA) and bronchial biopsies will be performed in order to eliminate differential diagnoses (pathology, electron microscopy). During this endoscopy, bronchial biopsies and a new nasal brushing will be performed in order to recover epithelial cells for in vitro studies. Some children with PIBO have only a partial response to treatment at 6 months and benefit from a new bronchial endoscopy. During this endoscopy, bronchial biopsies and nasal brushing will be performed in order to recover epithelial cells for in vitro studies. • Experimental plan First, a morphological study of the nasal epithelium of children presenting with PIBO versus that of children not developing PIBO will be carried out using a model of epithelium reconstituted in vitro in the air-liquid interface used routinely in the laboratory. The morphology of the nasal and bronchial epithelia of PIBO will also be analyzed during the evolution of the disease both ex vivo (fixed and paraffin-embedded biopsies) and in vitro. Several criteria will be analyzed such as cell composition, thickness and epithelial cohesion. Then, thanks to the in vitro culture model, a functional study of the epithelium will be carried out: - The production of pro-inflammatory and anti-viral mediators, involved in remodeling and epithelial-mesenchymal transition or which may be involved in the development of a PIBO will be measured at baseline. - The PIBO vs non-PIBO nasal epithelia will be subjected in vitro to viral stimulation (RVA16 or ADV) in order to mimic the initial exposure to the virus and better understand the differential response of epithelial cells to this infection. Finally, thanks to the use of single cell sequencing technology (scRNAseq), the transcriptomic profile of bronchial biopsies from children presenting with PIBO (n=3) will also be studied and compared to databases of “control” biopsies. (FasteQ, Human cell lung atlas). • Expected results This pilot study will allow the morphological and functional study of the respiratory epithelium of children developing a PIBO by both ex vivo and in vitro studies. It will allow a better understanding of the involvement of the epithelium during the evolution of the disease on the one hand but also according to its location in the respiratory tree (nose vs bronchus). The analysis of the transcriptome at the level of the single cell will make it possible to highlight, for the 1st time, the cellular heterogeneity and to follow the dynamics of cellular evolution during the disease (PIBO) which can serve as a basis for further studies. In parallel with this project, we are currently conducting a study of the prevalence in France of PIBO over the last 5 years. Feasibility The storage of the samples and the in vitro experiments will be done within the C2VN research laboratory (emerging team of Pr P. Chanez, under the responsibility of Dr D.Gras). The team masters the techniques of culture and analysis of the respiratory epithelium as well as the methods of viral infection (work in L2). For the scRNAseq, the ''Genomics and Bioinformatics'' platform of the MMG in Marseille will be involved. A CPP request is in progress for the taking of samples not provided for in the context of diagnosis or treatment.