Manipulation de l'intégrité mécanique de la titine pour étudier son rôle dans l'assemblage et la maintenance des sarcomères

Manipulating the mechanical integrity of titin to investigate its role in sarcomere assembly and maintenance

• Auteur / Autrice : Lina Herssi
• Direction : Frank Schnorrer
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie-Santé - Spécialité Biologie du Développement
• Date : Inscription en doctorat le 01/09/2023
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : IBDM - Institut de Biologie du Développement de Marseille
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : IBDM - Dynamique Musculaire

Mots clés

Mots clés libres

Drosophila

Muscle

Sarcomère

Titine

Tension mécanique

Clivage induit par TEV

Drosophila

Muscle

Sarcomere

Titin

Mechanical tension

TEV induced cleavage

Résumé

En tant qu'élément central du sarcomère, et en tant que lien mécanique clé entre les disques Z et les filaments de myosine, la titine a un rôle fondamental, à la fois dans le maintien de l'intégrité mécanique des sarcomères matures et dans l'assemblage du sarcomère lui-même. Afin de mieux comprendre le rôle mécanique de la titine dans la structure et la fonction des sarcomères, nous proposons de manipuler son intégrité mécanique in vivo pour la première fois et d'analyser les conséquences, du niveau moléculaire au niveau fonctionnel, dans les muscles en développement et matures dans le système modèle de la drosophile. Nous avons récemment généré une version de titine/Sallimus de drosophile qui peut être clivée au milieu par l'expression de la protéase virale TEV. Nous commencerons par caractériser cet outil génétique en induisant le clivage dans les muscles en développement et dans les sarcomères matures afin de caractériser le moment et l'efficacité du clivage de la titine après l'induction (Objectif 1). Nous examinerons ensuite les conséquences du clivage de la titine dans les sarcomères matures au niveau moléculaire et fonctionnel, mais aussi au niveau mécanique. En particulier, nous testerons les effets mécaniques du clivage de la titine en combinant l'outil TEV de clivage de la titine avec un capteur de tension moléculaire de titine récemment généré dans le laboratoire, et nous testerons si le clivage d'un sous-ensemble de molécules de titine augmente la force présente à travers les titines intactes restantes (Objectif 2). Enfin, nous étudierons quand les forces à travers la titine sont essentielles pour l'assemblage des sarcomères en clivant à différents stades du développement musculaire où l'assemblage des sarcomères peut être imagé avec une microscopie confocale à haute résolution et en direct. En outre, nous explorerons les conséquences de la perturbation de la mécanique de la titine au niveau transcriptionnel au cours d'une transition développementale clé afin d'identifier des voies potentielles de mécanotransduction (objectif 3). Ce projet combine la biologie cellulaire, la génétique, la transcriptomique et un large éventail d'outils moléculaires, y compris le marquage de protéines avec des marqueurs fluorescents, des capteurs de tension moléculaires et des systèmes d'expression génique inductibles, ainsi que de la microscopie confocale de pointe et de l'imagerie en direct des tissus musculaires en développement, afin de mieux comprendre comment l'intégrité mécanique de la titine influe sur l'assemblage et la maintenance des sarcomères. Comme les défauts de la titine, des sarcomères et de la contractilité musculaire sont fréquents dans les myopathies ou à un âge avancé, ces résultats permettront de mieux comprendre ces troubles et pourraient déboucher sur de nouvelles stratégies de traitement à l'avenir.

As a central element in the sarcomere, and as the key mechanical link between Z-discs and thick filaments, titin has a fundamental role, both in maintaining the mechanical integrity of mature sarcomeres and for sarcomere assembly itself. In order to better understand the mechanical role of titin in sarcomere structure and function, we propose to manipulate its mechanical integrity in vivo for the first time and analyse the consequences from the molecular level to the functional level in developing and mature muscles in the Drosophila model system. We have recently generated a Drosophila titin/Sallimus version that can be cleaved in the middle upon expression of the viral TEV protease. We will first characterise this genetic tool by inducing cleavage in developing muscles and in mature sarcomeres to characterise the timing and efficiency of titin cleavage after induction (Aim 1). We will then examine the consequences of cleaving titin in mature sarcomeres at the molecular and at the functional level, but also at the mechanical level. In particular, we will test the mechanical effects of titin cleavage by combining the TEV cleavable titin tool with a recently generated titin molecular tension sensor and test if cleaving a subset of titin molecules increases the force present across the remaining intact titins (Aim 2). Finally, we will investigate when forces across titin are essential for sarcomere assembly by cleaving at different stages during muscle development at which the assembly of sarcomeres can be imaged with high resolution and live confocal microscopy. In addition, we will explore the consequences of perturbing titin mechanics at the transcriptional level during a key developmental transition in order to identify potential mechanosensing pathways (Aim 3). Together, this project combines cell biology, genetics, transcriptomics, and a large array of molecular tools including protein tagging with fluorescent markers, molecular tension sensors and inducible gene expression systems, as well as state-of-the-art confocal microscopy, and live imaging of developing muscle tissues, to better understand how the mechanical integrity of titin impacts sarcomere assembly and sarcomere maintenance. As defects in titin, in sarcomeres and in muscle contractility are common in myopathies or in advanced age, these results will bring deeper understanding of these disorders and may lead to novel treatment strategies in the future.