Etude moléculaire et fonctionnelle de PTK7, un récepteur de la voie Wnt/PCP, dans le cancer colorectal.

Molecular and functional study of PTK7, a receptor of the Wnt/PCP pathway, in colorectal cancer.

• Auteur / Autrice : Louis Guiraud
• Direction : Jean-Paul Borg
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie-Santé - Spécialité Oncologie
• Date : Inscription en doctorat le 19/07/2022
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : CRCM - Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : CRCM - E5 - Polarité Cellulaire, Signalisation et Cancer

Mots clés

Mots clés libres

Cancer colorectal

Ptk7

Métastase

Colorectal cancer

Ptk7

Metastasis

Résumé

Le cancer colorectal (CCR) est à l'heure actuelle le second cancer le plus mortel au monde. L'absence de thérapie ciblée rend l'identification de nouveaux biomarqueurs urgente et nécessaire au développement de nouveaux traitements. Dans ce cancer, la voie Wnt/B-caténine est suractivée dans 90% des cas. Parmi les récepteurs impliqués dans l'activation de cette voie de signalisation, la pseudokinase membranaire PTK7 a récemment été caractérisée en tant que facteur pro migratoire sur-exprimé dans plusieurs types de cancers incluant le cancer colorectal. L'élaboration de thérapies ciblées, comprenant notamment l'utilisation de cellules immunitaires à récepteur antigénique chimérique ainsi que d'anticorps conjugués à une drogue dirigés contre PTK7, a permis de mettre en évidence le rôle de ce récepteur dans la tumorigénèse du CCR ainsi que l'intérêt de cibler cette protéine à l'échelle thérapeutique. Des données préliminaires non publiées par l'équipe du Docteur Jean-Paul Borg mettent en évidence l'implication de PTK7 dans la régulation de l'expression de la métalloprotéase MT1-MMP dans le CCR, impliquée dans l'invasion tumorale et la dissémination métastatique de plusieurs types de cancers. Cette métalloprotéase induisant également la formation d'invadopodes, ces données soulignent le rôle potentiel de PTK7 dans la régulation de l'invasion tumorale des cellules de CCR. D'autres données non publiées par l'équipe démontrent que l'expression membranaire de PTK7 diminue de façon importante dans les cellules tumorales circulantes (CTC) avant de ré-augmenter lors de la formation de métastases dans le CCR. Ce phénomène a été démontré dans des CTC issues de patients souffrant de CCR, et a été reproduit dans un modèle de souris xénogreffées avec des cellules de CCR HCT116. Ces résultats suggèrent que PTK7 possède également un rôle extrêmement important au cours de la diffusion métastatique et la progression du CCR. Considérés dans leur ensemble, ces résultats préliminaires suggèrent que 1) PTK7 possède un rôle déterminant dans les phases de développement précoces du CCR et que 2) ce récepteur a également une implication fondamentale lors de la formation de métastases et donc la progression de la maladie. La première partie de ce projet de thèse consistera donc à confirmer ou non l'implication de PTK7 dans la régulation de l'expression de la MT1-MMP ainsi que dans l'invasion cellulaire et la formation d'invadopodes. La MT1-MMP étant l'un des gènes dont l'expression est contrôlée par la voie Wnt/B-caténine, la première partie du projet consistera à traiter des cellules de CCR HCT116 avec un inhibiteur de l'interaction PTK7-B-caténine, et de mesurer l'expression de la MT1-MMP à l'échelle transcriptionnelle (RTq-PCR) et protéique (Western Blot). L'invasion cellulaire et la formation d'invadopodes seront mesurées par culture cellulaire en matrigel de collagène/gélatine-FITC. La seconde partie de ce projet de recherche sera focalisée sur l'étude du rôle de PTK7 dans la diffusion métastatique du CCR. Pour cela, nous prévoyons d'utiliser une construction PTK7-APEX déjà utilisée par l'équipe pour réaliser de la biotinylation de proximité et identifier l'intéractome de PTK7 dans les cellules de CCR HCT116. Ici, l'objectif sera d'utiliser ce système à l'échelle des cellules de tumeur primaire, des CTC ainsi que des cellules de métastase de CCR de façon à cartographier l'interactome de PTK7 à chaque étape de la progression du CCR. Dans ce contexte, les cellules seront rendues artificiellement circulantes par le biais d'un système de microfluidique et préalablement transfectées avec la construction PTK7-APEX. Les cellules réensemencées sur milieu solide après microfluidique simuleront le stade « métastase » des cellules de CCR, tandis que les cellules non soumises à ce système mimeront le stade « tumeur primaire ». Les interactomes de PTK7 identifiés au cours de ces trois étapes seront comparés, permettant d'identifier les interacteurs favorisant potentiellement l'intravasation des cellules de tumeur primaire et l'acquisition de leur statut « circulant ». La diminution de l'expression membranaire de PTK7 dans les CTC de CCR est due à un clivage protéolytique extrêmement important, aboutissant partiellement à la translocation nucléaire du domaine intracellulaire de PTK7. L'utilisation de la construction PTK7-APEX dans les CTC de CCR permettra également d'identifier l'interactome nucléaire de PTK7, mais aussi de caractériser son rôle au cours de la diffusion métastatique du CCR.

Colorectal cancer (CRC) is currently the second most deadly cancer in the world. The lack of targeted therapy makes the identification of new biomarkers urgent and necessary for the development of new treatments. In this cancer, the Wnt/B-catenin pathway is overactivated in 90% of cases. Among the receptors involved in the activation of this signalling pathway, the membrane pseudokinase PTK7 has recently been characterised as a pro-migratory factor over-expressed in several types of cancer including colorectal cancer. The development of targeted therapies, including the use of chimeric antigen receptor immune cells and drug-conjugated antibodies against PTK7, has highlighted the role of this receptor in CRC tumorigenesis and the value of targeting this protein therapeutically. Preliminary unpublished data from Dr Jean-Paul Borg's team highlight the involvement of PTK7 in the regulation of the expression of the MT1-MMP metalloprotease in CRC, which is involved in tumour invasion and metastatic dissemination of several types of cancers. As this metalloprotease also induces invadopodia formation, these data highlight a potential role for PTK7 in the regulation of tumour invasion of CRC cells. Other unpublished data from the team demonstrate that membrane expression of PTK7 decreases significantly in circulating tumour cells (CTCs) before increasing again during metastasis in CRC. This was demonstrated in CTCs from CRC patients and was reproduced in a mouse model xenografted with HCT116 CRC cells. These results suggest that PTK7 also has an extremely important role during metastatic spread and progression of CRC. Taken together, these preliminary results suggest that 1) PTK7 has a critical role in the early developmental stages of CRC and 2) this receptor also has a fundamental involvement in metastasis and thus disease progression. The first part of this thesis project will therefore consist of confirming or not the involvement of PTK7 in the regulation of MT1-MMP expression and in cell invasion and invadopodia formation. As MT1-MMP is one of the genes whose expression is controlled by the Wnt/B-catenin pathway, the first part of the project will consist of treating HCT116 CRC cells with an inhibitor of the PTK7-B-catenin interaction, and measuring the expression of MT1-MMP at the transcriptional (RTq-PCR) and protein (Western Blot) levels. Cell invasion and invadopodia formation will be measured by cell culture in collagen/gelatin-FITC matrigel. The second part of this research project will focus on studying the role of PTK7 in CRC metastatic spread. For this, we plan to use a PTK7-APEX construct already used by the team to perform proximity biotinylation and identify the PTK7 interactome in HCT116 CRC cells. Here, the aim will be to use this system at the scale of primary tumour cells, CTCs as well as CRC metastasis cells in order to map the PTK7 interactome at each stage of CRC progression. In this context, cells will be made artificially circulating via a microfluidic system and previously transfected with the PTK7-APEX construct. Cells reseeded on solid medium after microfluidics will simulate the 'metastasis' stage of CRC cells, while cells not subjected to this system will mimic the 'primary tumour' stage. The PTK7 interactomes identified during these three stages will be compared, allowing the identification of interactors potentially favouring the intravasation of primary tumour cells and the acquisition of their 'circulating' status. The decrease in PTK7 membrane expression in CRC CTCs is due to extremely high proteolytic cleavage, partially resulting in nuclear translocation of the intracellular domain of PTK7. The use of the PTK7-APEX construct in CRC CTCs will also allow the identification of the nuclear interactome of PTK7, but also to characterise its role during the metastatic spread of CRC.