Étude du remodelage nucléaire et de la stabilité du génome pendant la spermatogenèse par des analyses fonctionnelles de gènes mutés dans des cas d'infertilité masculine humaine.

Insights into nuclear remodeling and genome stability during spermatogenesis by functional studies of genes mutated in cases of human male infertility.

• Auteur / Autrice : Maha Al dala ali
• Direction : Michael Mitchell, Catherine Metzer-guillemain
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie-Santé - Spécialité Génétique
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 24/06/2024
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : MMG - Marseille Medical Genetics
• Jury : Président / Présidente : Patrice Roll
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Michael Mitchell, Deborah Bourchis, Nadege Vernet, Pierre Ray, Catherine Metzler-guillemain
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Deborah Bourchis, Pierre Ray

Mots clés

Mots clés libres

Infertilité

Spermiogenèse

Complexes de pore nucléaire

Rétrotransposons

Enveloppe nucléaire

Stabilité génétique

Infertility

Spermiogenesis

Nuclear pore complexes

Retrotransposons

Nuclear envelope

Genetic stability

Résumé

Environ 15% des couples dans le monde sont touchés par l'infertilité, dont la moitié présente un facteur masculin. Les causes génétiques, seules ou combinées à des facteurs environnementaux, sont considérés comme des causes majeures de l'infertilité masculine. L'ignorance de ces facteurs entrave une évaluation précise de la qualité génétique des gamètes et de son impact sur la descendance. Ainsi, l'identification des défauts génétiques est cruciale pour comprendre la physiopathologie d'infertilité masculine et ainsi personnaliser les traitements pour chaque couple infertile. Mon projet de thèse se concentre sur la caractérisation fonctionnelle de deux gènes spécifiques du testicule qui ont été trouvés inactivés dans deux cas d'infertilité masculine. 1) NUP210L, code une nucléoporine spécifique aux testicule une mutation homozygote de perte de fonction dans NUP210L a été identifiée chez un homme infertile présentant des têtes de spermatozoïdes décompactées. Nos résultats ont révélé que l'absence de NUP210L avait un impact modéré sur la morphologie de la tête et la motilité, mais que la compaction de la chromatine et la fertilité restait normale. Nous avons ensuite créé des souris knockout pour Banf2, codant le facteur de barrière à l'autointégration (BAF-L), qui colocalise avec NUP210L au niveau de l'enveloppe nucléaire caudale dans les spermatides humaines. L'absence de BAFL ne montre aucun impact sur la spermatogenèse ou la fertilité. Cependant, les double mutants pour Banf2 et Nup210l étaient infertiles. BAFL est devenu essentiel pour la fertilité de manière dose-dépendante dans le contexte génétique Nup210l-/-. Les souris Banf2+/- ; Nup210l-/- et Banf2-/- ; Nup210l-/- sont infertiles et présentent un blocage partiel de la spermiogenèse avec une oligozoospermie sévère et des anomalies dans l'organisation du réseau cytosquelettique autour du noyau. Notre travail montre clairement que BAF-L et NUP210L sont impliqués dans le même processus biologique qui assure un remodelage nucléaire efficace des spermatides. 2) EXD1 code la protéine exonucléase 3´-5´ domaine-contenant 1, impliqué dans la répression transcriptionnel des éléments transposables, médiée par piRNA. Notre équipe a découvert une mutation non-sens homozygote chez cinq frères infertiles présentant une oligozoospermie sévère. Nous avons étudié un modèle murin Exd1-KO sur un fond génétique outbred où les Exd1-/- mâles montrent deux phénotypes: un tiers sont infertiles avec des testicules atrophiés et une oligozoospermie sévère, tandis que les autres sont fertiles avec une spermatogenèse normale. Notre analyse de ce modèle révèle que les souris Exd1-KO infertiles présentent une forte dérépression des rétrotransposons LINE-1 dans les spermatocytes avec un blocage partiel au zygotène. Dans les prospermatogonies de 34% des souris nouveau-nées Exd1-KO, nous avons trouvé que MIWI2, un effecteur nucléaire de la méthylation de l'ADN au niveau des promoteurs LINE1, était exclusivement cytoplasmique, suggérant qu’un déficit de méthylation de l'ADN médiée par MIWI2, peut être la cause de l'infertilité dans nos souris Exd1-KO et dans le cas humain EXD1-KO. La différence de gravité phénotypique entre les souris Exd1-KO pourrait s'expliquer par la présence, chez les souris sévèrement affectées, d'une mutation dans un gène inconnu avec une redondance fonctionnelle par rapport à Exd1. En résumé, nos résultats montrent que l'étude de la fonction par l'inactivation d'un seul gène peut être obscurcie par une redondance fonctionnelle, la fonction ne devenant apparente qu'après l'inactivation d'un deuxième gène agissant dans le même processus biologique. Il est donc prudent de considérer le digénisme ou l'oligogénisme lors de l'évaluation des variants présents chez un homme infertile et dans la validation des variants chez la souris. Notre étude démontre l'importance de l'exploration du digénisme pour la découverte de fonctions gèniques et biologiques inimaginés.

Infertility affects 15% of couples worldwide, with a male factor identified in half of cases. Genetic defects are considered to be a significant cause of male infertility either alone or in association with environmental factors. Ignorance of causal factors prevents informed evaluation of gamete genome quality and its impact on future progeny. Identifying genetic defects will be vital to understanding the pathophysiology in each case of male infertility, allowing the optimization of personalized treatment for each infertile couple. My thesis project focuses on the functional characterization of two testis-specific genes that have been found inactivated in two separate cases of male infertility. 1) NUP210L, encodes a testis-specific nucleoporin. A homozygous loss-of-function mutation in NUP210L was identified in an infertile man exhibiting decompacted sperm heads. Our findings revealed that the inactivation of NUP210L had a mild impact on head morphology and motility (50%) but chromatin compaction remained normal, and fertility was unaffected. We then created knockout mice for Banf2, encoding Barrier to autointegration factor-like (BAF-L), that colocalizes with NUP210L at the caudal nuclear envelope in human elongating spermatids. The absence of BAF-L shows no discernible impact on spermatogenesis or fertility. However double mutants for Banf2 and Nup210l were infertile. Fertility becomes sensitive to BAF-L haploinsufficiency on the Nup210l-/- genetic background; Banf2+/-;Nup210l-/- and Banf2-/-;Nup210l-/- mouse are infertile, showing a partial block at mid spermiogenesis stage with severe oligozoopermia and anomalies in the organisation of the cytoskeletal scaffolding around the nucleus. Our work provides clear evidence that BAF-L and NUP210L are involved in functionally redundant biological process required for efficient nuclear remodelling of spermatids. 2) EXD1 encodes exonuclease 3´-5´ domain-containing 1, involved in piRNA-mediated transcriptional silencing of transposonable elements. Our team discovered a homozygous nonsense mutation in five infertile brothers with severe oligozoospermia. We developed an Exd1-KO mouse model on an outbred genetic background. We found that homozygous KO males present two phenotypes: a severe one where one third of males analysed, phenocopy the human case with infertility, atrophied testes and severe oligozoospermia, while the other group had normal fertility, testis size and sperm count. Our analysis of this model revealed that infertile Exd1-KO mice have strong de-repression of LINE-1 retrotransposons in spermatocytes with a partial block at zygonema. In the prospermatogonia of 34% of newborn Exd1-KO mice, we found that MIWI2, the piRNA-guided nuclear effector of DNA methylation at LINE1 promoters, was exclusively cytoplasmic, implying that a lack of MIWI2-mediated DNA methylation at LINE-1 promoters may be the cause of infertility in our Exd1-KO mice and in the human EXD1-KO familial case. The difference in phenotypic severity between Exd1-KO mice could indicate that severely affected mice carry a mutation in an unknown gene with functional redundancy to Exd1. In conclusion, our results show that the study of function using single gene inactivation in the mouse can be obscured by functional redundancy, with function only becoming apparent upon inactivation of a second gene that acts in the same biological process. Therefore, it is prudent to consider digenism or oligogenism during variant assessment of next generation sequencing data from infertile men and in the validation of candidate variants in mouse models. Our studies illustrate that the exploration of digenism has huge potential for the discovery of unimagined gene and biological function.