Dynamique des protéines et interactions par relaxométrie à haute résolution

Protein dynamics and interactions by high resolution relaxometry

• Auteur / Autrice : Ana Paula Aguilar alva
• Direction : Fabien Ferrage
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Chimie Physique
• Date : Inscription en doctorat le 01/09/2023
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Chimie physique et chimie analytique de Paris Centre (Paris ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire des biomolécules (Paris ; 2009-2024)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Structure and Dynamics of Biomolecules
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : École normale supérieure (Paris ; 1985-....)

Mots clés

Mots clés libres

Relaxométrie à haute résolution

Dynamique des protéines

Rmn

High resolution relaxometry

Protein dynamics

Nmr

Résumé

Ce projet de thèse consistera à étudier la dynamique protéique de deux systèmes différents : la protéine kinase p38g et les peptides formant de l'amyloïde. Au cours des deux premières années de ce projet de doctorat, nous utiliserons la résonance magnétique nucléaire (RMN) pour sonder la dynamique de la kinase p38g de 42 kDa et quantifier précisément l'effet de la liaison de l'inhibiteur et de la phosphorylation sur son ensemble conformationnel et sa dynamique à résolution atomique. Ce projet sera réalisé en collaboration avec Nicolas Wolff à l'Institut Pasteur et dans le cadre d'un projet européen multidisciplinaire. La famille p38 des protéines kinases activées par les mitogènes (MAPK) participe à l'adaptation des cellules aux changements de leur environnement et à l'inflammation. Les p38 kinases sont impliquées dans la régulation d'une myriade de processus cellulaires et s'adaptent à un large éventail de substrats. En tant que tel, p38 MAPK joue un rôle dans de nombreuses maladies, notamment le cancer et le diabète, et est devenu une cible pour la découverte de médicaments. La régulation de ces protéines par phosphorylation a été décrite d'un point de vue biologique. La phosphorylation fait passer les kinases p38 d'un état inactif à un état actif. Pourtant, les effets moléculaires de la phosphorylation ne sont pas aussi simples qu'un changement structurel. Nous utiliserons les groupes méthyle comme sondes d'équilibres conformationnels et de dynamiques dans p38g. À l'aide d'une nouvelle navette de relaxométrie à haute résolution, nous sonderons les mouvements des groupes méthyle sur des échelles de temps de l'ordre de la nanoseconde. Ces informations seront combinées avec des approches de transfert de saturation par échange chimique pour mieux comprendre le paysage de conformation de p38g. Avec une meilleure compréhension de l'état non phosphorylé de p38g, nous nous concentrerons ensuite sur l'expérimentation avec un échantillon phosphorylé. La première étape consistera à obtenir un échantillon homogène et stable de p38g dans son état phosphorylé. Ensuite, nous enregistrerons des expériences avec l'échantillon phosphorylé, avec un inhibiteur de la protéine et avec un mélange de l'échantillon phosphorylé et de son inhibiteur pour mieux comprendre l'allostérie, les changements conformationnels et les coûts entropiques associés aux changements de conformation. En caractérisant les équilibres conformationnels et en quantifiant les mouvements des chaînes latérales des protéines dans p38g, nous commencerons à dresser un tableau des effets moléculaires de la phosphorylation sur le paysage conformationnel de p38g. En fin de compte, ces résultats seront interprétés davantage avec une simulation de dynamique moléculaire pour obtenir une description complète de la dynamique à résolution atomique et guider le développement de nouveaux médicaments. En troisième année de ce projet de thèse, je contribuerai au projet DREAMY ANR, qui vise à construire une vision unifiée des premières étapes du processus d'auto-assemblage des peptides formant l'amyloïde en combinant physico-chimie, RMN et modélisation. techniques. À cette fin, nous tirerons parti des cristallophores (Ln-Xo4) que nous utiliserons à la fois comme outil pour interférer avec le processus d'auto-assemblage étudié et comme sonde locale des changements structurels et dynamiques en jeu. Plus précisément, je me concentrerai sur les espèces oligomères, qui sont insaisissables pour la plupart des techniques analytiques en raison de leur faible concentration, de leur hétérogénéité et de leur nature transitoire. Pourtant, l'interaction des monomères de Aβ avec des oligomères peut être sondée en observant Aβ1-28 libre par RMN et en exploitant son échange avec des oligomères. Une signature clé de l'interaction avec les oligomères peut être trouvée dans les propriétés de relaxation, en particulier les taux de relaxation longitudinale à faibles champs, que nous mesurerons par relaxométrie à haute résolution.

This PhD project will consist of studying protein dynamics of two different systems: the protein kinase p38g and amyloid-forming peptides. During the first two years of this PhD project, we will use Nuclear Magnetic Resonance (NMR) to probe the dynamics of the 42 kDa kinase p38g and quantify precisely the effect of inhibitor binding and phosphorylation on its conformational ensemble and dynamics at atomic resolution. This project will be carried out in collaboration with Nicolas Wolff at the Institut Pasteur and in the framework of a multidisciplinary European project. The p38 family of mitogen activated protein kinases (MAPK) participates in the adaptation of cells to changes in their environment and to inflammation. p38 kinases are involved in the regulation of a myriad of cellular processes and accommodate a broad range of substrates. As such, p38 MAPK play roles in many diseases, including cancer and diabetes and have become targets for drug discovery. The regulation of these proteins by phosphorylation has been described from a biological perspective. Phosphorylation turns p38 kinases from an inactive state to an active state. Yet, the molecular effects of phosphorylation are not as simple as a structural switch. We will use methyl groups as probes of conformational equilibria and dynamics in p38g. Using a new high-resolution relaxometry shuttle, we will probe motions of the methyl groups on nanoseconds timescales. This information will be combined with chemical exchange saturation transfer approaches to further understand the conformation landscape of p38g. With a better understanding of the unphosphorylated state of p38g we will then focus on experimenting with a phosphorylated sample. The first step will be to achieve a homogenous stable sample of p38g in its phosphorylated state. Then, we will record experiments with the phosphorylated sample, with an inhibitor of the protein and with a mixture of the phosphorylated sample and its inhibitor to gain insight into the allostery, conformational changes and entropic costs associated with the changes in conformation. By characterizing conformational equilibria and quantifying motions of protein side chains in p38g, we will start to draw a picture of the molecular effects of phosphorylation on the conformational landscape of p38g. Ultimately, these results will be further interpreted with molecular dynamics simulation to gain a full description of dynamics at atomic resolution and guide the development of new drugs. In the third year of this PhD project, I will contribute to the DREAMY ANR project, which aims at building up a unified view of the first steps of the self-assembly process of amyloid-forming peptides by combining physico-chemical, NMR and modelling techniques. To that end, we will take advantage of the crystallophores (Ln-Xo4) that we will use both as a tool to interfere with the self-assembly process under study and as a local probe of structural and dynamic changes at play. More precisely, I will focus on oligomeric species, which are elusive for most analytical techniques due to their weak concentration, heterogeneity, and transient nature. Yet, the interaction of monomers of Aβ with oligomers can be probed by observing free Aβ1-28 by NMR and exploiting its exchange with oligomers. A key signature of interaction with oligomers can be found in relaxation properties, particularly longitudinal relaxation rates at low fields, which we will measure with high-resolution relaxometry.