Evaluation de la glycosylation de l'hormone chorionique gonadotrope humaine comme biomarqueur d'exposition placentaire aux perturbateurs endocriniens

Evaluation of human chorionic gonadotropin glycosylation as placental exposure to endocrine disrupters

• Auteur / Autrice : Chi-Phong Ly
• Direction : Nguyet Thuy Tran
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences chimiques : molécules, matériaux, instrumentation et biosystèmes
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Galien Paris-Saclay
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Faculté de pharmacie

Mots clés

Mots clés libres

Gouttes microfluidiques

Traitement d'échantillon

Billes magnétiques

Techniques séparatives

Spectrométrie de masse

Protéine

Lab-in-droplet

Sample treatment

Magnetic beads

Separation techniques

Mass spectrometry

Protein

Résumé

La glycosylation, une des principales modifications post-traductionnelles des protéines, est fortement modifiée lors de diverses pathologies. L'hormone chorionique gonadotrope humaine (human chorionic gonadotropin, hCG) est une glycoprotéine hétérodimérique fortement glycosylée (la sous-unité alpha contient 2 sites de N-glycosylation et la beta contient 2 sites de N- et 4 sites de O-glycosylation) [1], ce qui représente donc une microhétérogénéité très importante et complexe. L'hCG est une hormone essentielle de la grossesse produite par les cellules trophoblastiques dès l'implantation du conceptus. Sa glycosylation varie en fonction du terme de la grossesse [2] mais peut également être altérée en cas de grossesse pathologique [3], de tumeurs gestationnelles ou non [4]. Les contaminants environnementaux notamment les perturbateurs endocriniens, possiblement toxiques vis-à-vis du placenta, peuvent altérer la production d'hCG et ainsi causer des anomalies fœtales [5]. Dans ce contexte, il est intéressant d'évaluer le profil glycanique de l'hCG comme biomarqueur potentiel d'exposition prénatale inappropriée de la femme enceinte aux polluants. L'objectif de cette thèse est de répondre à cette problématique de diagnostic en développant des plateformes pour l'analyse des N- et O-glycanes libérés de l'hCG tout en automatisant la préparation d'échantillons (dénaturation et digestion enzymatique de la protéine, dérivation par fluorescence des glycanes libérés). L'étudiant(e) fera évoluer le système « Lab-in-droplet » reposant sur l'utilisation de billes magnétiques en format de gouttes microfluidiques développé récemment au laboratoire d'accueil pour la préparation des N-glycanes [6]. Il ou Elle réalisera de nouveaux développements pour intégrer d'autres étapes d'isolement et d'enrichissement des sous-unités de l'hCG ou optimiser les étapes de libération de O-glycanes et de dérivation des glycanes avec un marqueur adapté à l'analyse chromatographique (différent de celui utilisé pour l'analyse électrophorétique). La versatilité de ce système puissant permettra de préparer tous types de glycanes (N- et/ou O-) analysables par différentes techniques. La séparation difficile des glycanes de structures très proches (notamment des isomères de position présents naturellement pour un même glycane) sera réalisée par des techniques orthogonales (chromatographie liquide et électrophorèse capillaire) en exploitant leur pouvoir séparatif élevé. Basé sur les cartes glycaniques ainsi obtenues, les proportions relatives des glycanes seront utilisées comme paramètres déterminants pour détecter différemment, par des méthodes complémentaires, les modifications de glycosylation provoquées par différents perturbateurs endocriniens (chimiques et particulaires). Si les signatures révèlent des différences de glycosylation significatives entre des groupes exposés / non exposés, des explorations plus approfondies pour identifier le(s) glycane(s) d'intérêt seront entreprises. L'étudiant(e) réalisera ainsi le couplage direct de ces techniques avec des spectromètres de masse à haute résolution (Orbitrap, Q-TOF) extrêmement performants pour l'identification structurale. [1] Guibourdenche J. et al., JCEM, 95 (2010) E240-E244 [2] Cole L.A., Placenta, 28 (2007) 977-986 [3] Frendo J-L et al., J Clin Endocrinol Metab 89 (2004) 727-732 [4] Kobata A et al., Biochem Biophys Acta 1455 (1999) 315-326 [5] Paulesu L et al., Intern J of Mol Sci, 19 (2018) 914-625 [6] Lienard--Mayor T et al., Anal Chim Acta, 1221 (2022) 340150

Glycosylation, one of the main post-translational modifications of proteins, is strongly modified in various pathologies. Human chorionic gonadotropin (hCG) is a highly glycosylated heterodimeric glycoprotein (the alpha subunit contains 2 N-glycosylation sites and the beta contains 2 N- and 4 O-glycosylation sites) [1], thus representing a very high and complex microheterogeneity. hCG is an essential hormone produced by trophoblastic cells of the placenta during pregnancy. Its glycosylation varies with the term [2] but may also be altered in case of pathologic pregnancy [3], gestational or nongestational tumors [5]. Environmental contaminants including endocrine disruptors which are potentially toxic to the placenta, can impair hCG production and thus cause fetal abnormalities. In this context, it is interesting to evaluate the glycan profiling of hCG as a potential biomarker of inappropriate prenatal exposure of pregnant women to pollutants. The aim of this thesis is to answer to this diagnostic question by developing platforms for the analysis of N- and O-glycans released from hCG while automating the sample preparation (denaturation and enzymatic digestion of the protein, fluorescence derivation of the released glycans). The student will develop the “Lab-in-droplet” system based on the use of magnetic beads in microfluidic droplet format, which was recently developed in the host laboratory to prepare N-glycans [6]. He/She will carry out new developments to integrate other steps like hCG sub-unit isolation and enrichment or optimize the O-glycan release and glycan derivation using a dye suitable for chromatographic analysis (different from that used for electrophoretic analysis). The versatility of this system will allow preparation of all types of glycans (N- and/or O-) that can be analyzed by different complementary techniques. The challenging separation of glycans exhibiting very close structures (in particular position isomers present naturally for a same glycan) will be carried out using orthogonal techniques (liquid chromatography and capillary electrophoresis) by exploiting their high separation power. Based on the glycan mapping obtained, the relative proportions of glycans will be used as critical parameters to detect differently by complementary methods, the modifications of glycosylation caused by different endocrine disruptors (chemical and particulate). If the signatures reveal significant differences in glycosylation between exposed/unexposed groups, further investigations will be undertaken to identify the glycan(s) of interest. The student will then directly couple these techniques with high-resolution mass spectrometers (Orbitrap, Q-TOF) with extremely high-performance for structural identification. [1] Guibourdenche J. et al., JCEM, 95 (2010) E240-E244 [2] Cole L.A., Placenta, 28 (2007) 977-986 [3] Frendo J-L et al., J Clin Endocrinol Metab 89 (2004) 727-732 [4] Kobata A et al., Biochem Biophys Acta 1455 (1999) 315-326 [5] Paulesu L et al., Intern J of Mol Sci, 19 (2018) 914-625 [6] Lienard--Mayor T et al., Anal Chim Acta, 1221 (2022) 340150