Développements de méthodes chromatographiques et de spectrométrie de masse pour la caractérisation structurale de l'oxydation de protéines

Advances in chromatography and mass spectrometry methods for protein structural characterization through amide H/D exchanges

• Auteur / Autrice : Eva Audouin
• Direction : Guillaume Van der rest, Isabelle Billault
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences chimiques : molécules, matériaux, instrumentation et biosystèmes
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Chimie Physique
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : CAPRI
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Faculté des sciences d'Orsay

Mots clés

Mots clés libres

Approches biostructurales

Oxydation de protéines

Photodissociation UV

Échanges H/D d'amide

Spectrométrie de masse

Protein oxidation

Amide H/D exchange

Mass spectrometry

Biostructural approaches

UV Photodissociation

Résumé

Le développement des techniques de caractérisation structurale de protéines et d'assemblages protéiques en utilisant les outils de la spectrométrie de masse est le coeur de l'activité de l'équipe 'biologie structurale par spectrométrie de masse' de l'ICP. Dans le cadre du projet UPHEBOS (Ultraviolet Photodissociation and Hydrogen/Deuterium Exchange for Biomolecule Structure and Oxidation) financé par l'ANR, ce projet de thèse vise au développement des outils nécessaires pour permettre la mesure de modifications conformationnelles sur des protéines oxydées par des mesures d'échanges H/D d'amide résolues à l'acide aminé près. Les composants à développer dans ce cadre sont de deux ordres: d'une part développer des techniques de chromatographie basse température qui permettront d'allonger la durée expérimentale pendant laquelle le marquage initial est conservé; d'autre part explorer la capacité de techniques d'activation alternatives à l'ECD et l'ETD - en particulier celle de l'UVPD - à conserver intacte la localisation des deutériums lors du processus d'activation - dissociation, étape indispensable pour permettre la localisation précise des marquages isotopiques. Sur ce dernier point la littérature actuelle apporte des informations contradictoires et le parc instrumental unique de l'ICP (spectromètres de masse FT-ICR, piège quadripolaires et Q-TOF) permettra d'explorer le rôle des paramètres instrumentaux influent la migration des deutérium lors d'une étape d'activation UV. L'intégration de l'allongement du temps expérimental disponible pour la MS/MS et d'une méthodologie de photodissociation UV optimisée pour minimiser les migrations conduira dans un dernier temps de cette thèse à étudier les modifications structurales sur des protéines et complexes de protéines induites par les phénomènes d'oxydation.

The development of a protein structural characterization toolbox based on mass spectrometry is the core of the work perfomed in the 'mass spectrometry for structural biology' team at the ICP. In the framework of the UPHEBOS (Ultraviolet Photodissociation and Hydrogen/Deuterium Exchange for Biomolecule Structure and Oxidation) ANR funded project, the current thesis project aims at the development of tools that are required to achieve the measurement of proteion conformational changes through amide H/D exchange measurements resolved at the amino-acid level. Two sets of prerequisites have to be developed to achieve this goal: on the one side, developping low temperature chromatographic separation techniques will allow an increase in the experimental time slot during which the initial labelling is kept intact; on the other side, we intend to explore activation techniques that could be alternates to ECD and ETD - and especially UVPD - in keeping the original deuterium localization during the activation stage. On this latter point, the current litterature shows contradictory results, and the unique instrumental setups that are available at the ICP (FT-ICR, ion trap and Q-TOF mass spectrometers) will allow a thorough exploration of the instrumental parameters which are key to deuterium migration in the UV activation step. Integrating a longer acquisition time available for MS/MS and an optimized UV photodissociation stage that minimizes deuterium migrations will lead, in the last stage of this project, to study the structural changes induced by oxidation processes on proteins and protein complexes.