Étude de la logique du réseau de régulation de la chromatine grâce à la génomique fonctionnelle

Investigating the logic of the chromatin regulatory network through functional genomics

• Auteur / Autrice : Hedvika Martin
• Direction : Michel Wassef
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Génétique et génomique
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2023
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Génétique et biologie du développement (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Mécanismes de Répression par les Protéines Polycomb
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Institut Curie (Paris ; 1978-....)

Mots clés

Mots clés libres

Épigénétique

Chromatine

Régulation

Génomique fonctionelle

Epigenetics

Chromatin

Regulation

Functional genomics

Résumé

La chromatine des cellules eucaryotes joue un rôle clé dans le contrôle de la transcription des gènes. Des centaines de régulateurs de la chromatine mettent en œuvre des états chromatiniens permissifs ou répressifs sur le plan de la transcription.Les régulateurs de la chromatine sont fréquemment mutés dans diverses maladies humaines telles que le cancer. Cependant, leurs rôles respectifs et la nature des liens fonctionnels (coopération, antagonisme, redondance) entre les membres de ce vaste réseau de régulation de la chromatine restent mal compris, ce qui limite leur manipulation pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les études sur les régulateurs de la chromatine sont réalisées dans une variété de systèmes modèles et cela empêche l'intégration de ces données hétérogènes. Nous ne disposons donc pas d'une image complète du réseau de régulation de la chromatine. Le laboratoire hôte a émis l'hypothèse que l'activité des régulateurs de la chromatine est orchestrée autour d'un nombre limité de fonctions qui peuvent être révélées par une analyse intégrative. En raison du rôle central des protéines Polycomb dans la régulation de la chromatine, le laboratoire s'intéresse également à la clarification des relations fonctionnelles entre les régulateurs de la chromatine et la machinerie Polycomb. Des études antérieures ont montré que les approches de génomique fonctionnelle et les analyses d'épistasie permettent d'étudier les interactions fonctionnelles entre les régulateurs de la chromatine (e.g., Campagne et al., 2019). Mon projet de thèse vise à porter ces approches à une nouvelle échelle pour déchiffrer la logique du réseau de régulation de la chromatine et ainsi découvrir de nouvelles interactions fonctionnelles qui peuvent être utilisées pour concevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les maladies humaines. Objectif 1- Evaluation systématique de la « dépendance aux protéines Polycomb » des régulateurs de la chromatine Nous avons obtenu les premiers résultats d'une expérience Perturb-seq dans des cellules de type sauvage en utilisant une librairie sgRNA personnalisée ciblant 300 régulateurs de la chromatine. Ces résultats valident l'efficacité de l'approche Perturb-seq, suggèrent des modules inattendus et permettent enfin de sélectionner les sgRNA les plus performants. Ici, j'évaluerai systématiquement, pour chacun de ces régulateurs de la chromatine, dans quelle mesure leur fonction repose sur les protéines du groupe Polycomb. Pour ce faire, je procéderai à des analyses comparatives Perturb-seq dans des lignées cellulaires de type sauvage et dans diverses lignées cellulaires knock-out Polycomb. Précédemment, en utilisant un raisonnement similaire (Campagne et al., 2019), l'équipe hôte a montré que BAP1, un complexe modifiant la chromatine, n'a aucun effet en l'absence de PRC1 et agit donc en aval de PRC1 (c'est-à-dire que PRC1 est épistatique à BAP1). En étendant ce type d'analyse, je serai en mesure d'identifier systématiquement de nouvelles relations fonctionnelles entre la machinerie Polycomb et d'autres régulateurs de la chromatine. Objectif 2- Analyse du réseau d'interactions génétiques entre les régulateurs chromatiniens Notre première expérience Perturb-seq a révélé des modules fonctionnels inattendus, c'est-à-dire des signatures transcriptomiques similaires pour des régulateurs de la chromatine qui ne sont pas connus pour agir dans la même voie. Dans ce deuxième objectif, je chercherai à déterminer les relations épistatiques à l'œuvre dans ces modules, c'est-à-dire à savoir si les facteurs impliqués agissent dans les mêmes voies ou dans des voies parallèles/redondantes. Pour explorer ces relations, j'utiliserai des cribles combinatoires CRISPR pour comparer l'impact sur le transcriptome des knockdowns combinés par rapport aux knockdowns individuels. Nous nous attendons à ce que le knockdown combiné de deux gènes agissant dans la même voie aboutisse à un phénotype identique ou plus léger que la somme des phénotypes individuels. Au contraire, l'invalidation combinée de deux gènes agissant dans des voies redondantes devrait entraîner un phénotype plus profond que les invalidations individuelles. J'utiliserai les résultats de la première expérience Perturb-Seq (dans des cellules de type sauvage) pour sélectionner quelques modules pour lesquels j'effectuerai l'analyse combinatoire. OBJECTIF 3 - Étudier la pertinence des interactions nouvellement identifiées dans le contexte de la différenciation des cellules souches embryonnaires de souris Les données recueillies dans le cadre des objectifs 1 et 2 permettront de découvrir de nouvelles interactions fonctionnelles. L'étape suivante consistera à valider ces interactions dans le contexte de la différenciation des cellules souches embryonnaires de souris (cellules ES) afin de déterminer l'importance de ces interactions au cours des processus de développement. Pour ce faire, je réaliserai des expériences de perte de fonction simple ou double dans les cellules ES en perturbant la stabilité des régulateurs chromatiniens candidats au niveau protéique(stratégies dTAG et degron inductible à l'auxine) et je déclencherai la différenciation en cellules progénitrices neurales (CPN) (Petracovici et al., 2021, Gouti et al., 2014). En quantifiant les marqueurs de pluripotence et de différenciation, je serai en mesure d'étudier l'importance des interactions fonctionnelles nouvellement découvertes au cours de la différenciation.

The chromatin of eukaryotic cells plays a key role in controlling gene transcription. Hundreds of chromatin regulators implement transcriptionally permissive or repressive chromatin states. Importantly, chromatin regulators are frequently mutated in diverse human diseases such as cancer. However, their respective roles and the nature of the functional links (cooperation, antagonism, redundancy) between the members of this vast chromatin regulatory network remain poorly understood, limiting their manipulation for the development of novel therapeutic strategies. Studies on chromatin regulators are performed in a variety of model systems, thus precluding an integration of such heterogeneous data. We consequently lack a comprehensive picture of the chromatin regulatory network. The host lab hypothesized that the activity of chromatin regulators is orchestrated around a limited number of functions that can be revealed by an integrative analysis. Owing to the central role of Polycomb proteins in chromatin regulation, the lab is further interested in clarifying the functional relationships between chromatin regulators and the Polycomb machinery. Previous studies have shown that functional genomics approaches and epistasis analyses enable the investigation of functional interactions between chromatin regulators (e.g., Campagne et al., 2019). My PhD project aims to bring these approaches to a new scale to decipher the logic of the chromatin regulatory network and thereby uncover novel functional interactions that can be used to design new therapeutic strategies for human diseases. AIM 1- Systematic evaluation of the ''Polycomb-dependency'' of chromatin regulators We have obtained the first results of a Perturb-seq experiment in wild-type cells using a custom sgRNA library targeting 300 chromatin regulators. It validates the effectiveness of the Perturb-seq approach, suggests unexpected modules and finally enables the selection of best-scoring sgRNAs. Here, I will systematically evaluate, for each of these chromatin regulators, the extent to which their function relies on the Polycomb group proteins. This will be achieved by comparative Perturb-seq analyses in wild-type versus various Polycomb knockout cell lines. Previously, using a similar rationale (Campagne et al., 2019), the host team has shown that BAP1, a chromatin-modifying complex, has no effect in the absence of PRC1 and is therefore acting downstream of PRC1 (i.e., PRC1 is epistatic to BAP1). By extending this type of analysis, I will be able to systematically identify new functional relationships between the Polycomb machinery and other chromatin regulators. AIM 2- Analysis of the network of genetic interactions between chromatin regulators Our first Perturb-seq experiment revealed unexpected functional modules, or in other words, similar transcriptomic signatures for chromatin regulators not known to act in the same pathway. In this second aim, I will seek to determine the epistatic relationships at work within these modules, i.e. whether the factors involved act in the same or parallel/redundant pathways. To explore these relationships, I will use combinatorial CRISPR screens to compare the impact of combined versus individual knockdowns on the transcriptome. We expect the combined knockdown of two genes acting in the same pathway to result in an identical or milder phenotype than the sum of individual phenotypes. On the contrary, the combined knockdown of two genes acting in redundant pathways is expected to result in a more profound phenotype than individual knockdowns. I will use the results of the first Perturb-Seq experiment (in wild-type cells) to select a few modules for which I will perform the combinatorial analysis. AIM 3 - Investigate the relevance of newly identified interactions in the context of mESC differentiation The data gathered in Aims 1 and 2 will uncover new functional interactions. The next step will be to validate these interactions in the context of mouse embryonic stem cell (mESC) differentiation to tackle the importance of these interactions during developmental processes. To do so, I will generate single or double loss-of-function experiments in mESCs by perturbing the stability of the candidate chromatin regulators at the protein level (dTAG and auxin-inducible degron strategies) and trigger differentiation into neural progenitor cells (NPCs) (Petracovici et al., 2021, Gouti et al., 2014). By quantifying pluripotency and differentiation markers I will be able to investigate the importance of newly discovered functional interactions during differentiation.