Glycosylation chimique customisée de protéines recombinantes

Custom chemical glycosylation of recombinant proteins

• Auteur / Autrice : Léa Latour
• Direction : Sébastien Fort, Sandrine Py
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Chimie Biologie
• Date : Inscription en doctorat le 02/10/2023
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : CEntre de Recherche sur les MAcromolécules Végétales

Mots clés

Mots clés libres

Glycoprotéines

Bioconjugaison

Oligosaccharides

Glycoproteins

Bioconjugation

Oligosaccharides

Résumé

La demande croissante de biothérapies et d'enzymes industriels stimule d'intenses recherches sur la production de protéines recombinantes. La plupart des protéines sont naturellement modifiées avec des oligosaccharides jouant un rôle majeur sur leur pliage, leur stabilité et leur activité. Malgré les progrès continus réalisés dans les systèmes d'expression des protéines, la glycosylation reste un problème majeur. En effet, quel que soit le système choisi, le modèle de glycosylation est spécifique à l'organisme hôte et des glycoformes hétérogènes sont produites. La conjugaison chimique est une alternative prometteuse pour la glycosylation des protéines. Les acides aminés exposés en surface (cystéines, lysines) peuvent être ciblés, mais la sélectivité de couplage est difficile à contrôler. La méthionine (Met) a récemment émergé comme acide aminé clé pour la modification des protéines par marquage chimique actif redox (ReACT). La réaction chimiosélective entre le Met et les oxaziridines a permis une modification efficace des polypeptides avec de petites molécules. À notre connaissance, la glycosylation protéique avec des oligosaccharides par ReACT n'a jamais été signalée jusqu'à présent. POOLING vise à combler cette lacune. Le projet se concentrera sur le développement de nouvelles voies synthétiques vers les oxaziridines et les diaziridines en tant que précurseurs des réactifs ReACT glycosylés via CuAAC. La réactivité de ces réactifs ReACT à base d'oligosaccharides sera évaluée sur un peptide modèle avant d'implémenter la technologie au niveau protéique. Comme preuve de concept, nous étudierons la glycosylation d'une enzyme de dégradation de la paroi cellulaire bactérienne BaGH25c. Cette enzyme est un outil intéressant pour étudier le remodelage de la paroi dans le contexte de la résistance aux antimicrobiens, cependant, ce travail est compromis par la faible stabilité de la protéine recombinante. La glycosylation de BaGH25c avec différents types d'oligosaccharides sera effectuée et la stabilité et l'activité des enzymes modifiées seront évaluées.

The growing demand for biotherapeutics and industrial enzymesstimulates intense research on the production of recombinant proteins. Most proteins are naturally modified with oligosaccharides playing a major role on their folding, stability and activity. In spite of continuous progresses made in protein expression systems, glycosylation remains a major issue. Indeed, whatever the system selected, the glycosylation pattern is specific to host organism and heterogenous glycoforms are produced. Chemical conjugation is a promising alternative for the glycosylation of proteins. Surface exposed amino-acids (cysteines, lysines) can be targeted; however, the coupling selectivity is difficult to control. Methionine (Met) has recently emerged as key amino-acid for protein modification by Redox Active Chemical Tagging (ReACT). Chemoselective reaction between Met and oxaziridines allowed efficient site-specific modification of polypeptides with small molecules. To the best of our knowledge, protein glycosylation with oligosaccharides by ReACT has never been reported so far. POOLING aims to fill this gap. The project will focus on the development of new synthetic pathways to oxaziridines and diaziridines as precursors of glycosylated ReACT reagents via CuAAC click chemistry. The reactivity of these oligosaccharide-based ReACT reagents will be evaluated on a model peptide before implementing the technology at the protein level. As a proof of concept, we will study the glycosylation of a bacterial cell-wall (BCW) degrading enzyme BaGH25c. This enzyme is an interesting tool to study BCW remodeling in the context of antimicrobial resistance however, this work is impaired by the poor stability of the recombinant protein. Glycosylation of BaGH25c with different types of oligosaccharides will be performed and the stability and activity of the modified enzymes will be evaluated.