Aspects spatio-temporels de la Traduction et de l' Assemblage du SARS-CoV-2

Spatio-temporal characterization of viral RNA translation and assembly of SARS-CoV-2

• Auteur / Autrice : Damien Avinens
• Direction : Delphine Muriaux, Cyril Favard
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2023
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : IRIM - Institut de Recherche en Infectiologie de Montpellier
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Domaines membranaires et assemblage viral

Mots clés

Mots clés libres

Biologie de l'ARN

Traduction

Microscopies avancées quantitatives

Assemblage viral

Viral Assembly

RNA biology

Advanced quantitative microscopy

Translation

Résumé

Le SARS-CoV2 est un problème majeur pour la santé publique et dans le monde entier, car il est responsable de la pandémie de COVID-19, toujours en cours. Le SARS-CoV2 est un virus enveloppé d'ARN qui appartient à la famille des betacoronaviridae et qui infecte principalement les cellules pulmonaires humaines, provoquant la destruction des cellules cibles et des maladies respiratoires graves. Des percées en recherche fondamentale sur la localisation, la traduction, et l'encapsidation de l'ARN génomique puis sur la formation des particules virales qui en découle sont encore nécessaires pour faciliter le développement de nouvelles thérapeutiques contre le SARS-CoV2 ou encore de vaccins. La localisation, la traduction, et l'encapsidation de l'ARN viral et l'assemblage des particules virales sont des processus complexes et hautement régulés qui se produisent pendant les phases tardives de réplication du SARS-CoV-2 [1]. Ils sont étroitement orchestrés les uns avec les autres car ils sont souvent mutuellement exclusifs. La localisation et la traduction de l'ARN viral ont toujours lieu en premier, afin de constituer un stock de protéines virales qui serviront à assembler la particule virale nouvellement fabriquée contenant l'ARN génomique fonctionnel. La localisation et la traduction de l'ARN de SARS-CoV2 n'ont jamais été étudiées au niveau de la molécule unique, principalement en raison du manque d'outils. Pourtant, il est crucial de comprendre quand et où les ARNm viraux sont traduits et synchronisent la production de protéines virales, l'amplification de l'ARN génomique ainsi que son encapsulation dans la particule virale nouvellement formée. L'objectif de cette thèse est de caractériser quantitativement les mécanismes moléculaires et cellulaires qui favorisent la coordination entre l'amplification des ARNs, la traduction et plus tard l'assemblage du SARS-CoV2 dans les cellules hôtes pulmonaires humaines. Nous nous concentrerons sur la régulation moléculaire de la localisation et de la cinétique de traduction de l'ARNm viral, afin d'aborder la coordination spatio-temporelle de la production des protéines virales structurales ainsi que l'amplification de l'ARN génomique pour une incorporation/production optimale des particules. La localisation et la cinétique de traduction de l'ARN viral dans les cellules pulmonaires vivantes seront suivies à l'aide du marquage SunTag [2]. Le marquage à couleurs multiples permettra la visualisation concomitante des protéines virales marquées nouvellement traduites. En réalisant des expériences en temps réel, nous détecterons la localisation de l'ARNm viral et mesurerons le délai entre la traduction et les graines naissantes de l'assemblage des particules dans le cytosol des cellules vivantes, ainsi que l'assemblage final au niveau de la membrane en utilisant des microscopes de pointe, soit à réseau de lumière (Zeiss LLS7), soit confocaux à haute vitesse (LSM980 avec airyscan rapide) (installation IRM de Montpellier) ou des microscopies de localisation de molécules uniques (installation BSL3 du CEMIPAI). Les mouvements moléculaires des différents composants (protéines virales, ARN) seront suivis par spectroscopie de corrélation de fluorescence [3,4] et par suivi de particules uniques [5,6] dans les cellules pulmonaires hôte du virus, avec un potentiel de transposition in vivo au cours de la thèse. L'ensemble du projet permettra de mieux comprendre la réplication temporelle du SARS-CoV-2 entre la traduction de l'ARNm des protéines virales structurales jusqu'à la biogenèse des particules virales.

SARS-CoV2 is worldwide a major public health burden as the main cause of the still ongoing COVID-19 pandemic. SARS-CoV2 is an RNA enveloped virus that belongs to the Betacoronaviridae family that infect mainly human pulmonary cells creating a destruction of the target cells and severe respiratory diseases. Basic research breakthroughs in viral RNA localization, translation, packaging and particle formation are still needed and would facilitate the development of new therapeutics against SARS-CoV2 or vaccins. Viral RNA localization, translation, packaging and particle assembly are complex and highly regulated processes occurring during the late phases of SARS-CoV-2 replication [1]. They are tightly orchestrated with one another as they are often mutually exclusive. Viral RNA localization and translation always takes place first, in order to constitute a stock of viral proteins that will serve to assemble the newly made viral particle containing a functional genomic RNA. Sars-CoV2 RNA localization and translation has never been studied at the single molecule level, mainly due to the lack of tools. However, it is crucial to understand when and where viral mRNAs are translated and synchronize viral protein production, genomic RNA amplification as well as it packaging within the newly formed viral particle. The aim of this thesis is to quantitatively characterize the molecular and cellular mechanisms that promote coordination between RNAs amplification, translation and later on assembly of SARS-CoV2 in human pulmonary host cells. We will focus on molecular regulation of viral mRNA localisation and translation kinetic, to address the spatio-temporal coordination of viral structural protein production zs well as genomic RNA amplification for optimal particle incorporation/production. Localization and kinetics of viral RNA translation in living pulmonary cells will be monitored using SunTag labelling [2]. Multiple color tagging will allow concomitant visualization of newly translated tagged viral proteins. By performing time course experiments, we will detect the localization of viral mRNA and measure the delay between translation and nascent seeds of particle assembly in the cytosol of living cells, as well as final assembly at the membrane using cutting edge microscope either lattice light sheet (Zeiss LLS7), high speed confocal (LSM980 with fast airyscan) (MRI facility Montpellier) or single molecule localization microscopies (CEMIPAI BSL3 facility). Molecular motions of the different components (viral proteins, RNA) will be monitored by fluorescence correlation spectroscopy [3,4] and single particle tracking [5,6] in host pulmonary cells, with a potential to transpose to in vivo models during the PhD thesis. The project as a whole will provide a better understanding of the spatio-temporal replication of SARS-CoV-2 between mRNA translation of structural viral proteins to particle biogenesis.