ETUDE DU RÔLE NEURODEVELOPPEMENTAL DU RÉCEPTEUR 5-HT6 DE LA SÉROTONINE DANS UN MODÈLE DE CORTICOGENÈSE À PARTIR DE CELLULES SOUCHES EMBRYONNAIRES

STUDY OF THE NEURODEVELOPMENTAL ROLES OF THE SEROTONIN 5-HT6 RECEPTOR IN A CORTICOGENESIS MODEL FROM EMBRYONIC STEM CELLS

• Auteur / Autrice : Clémence Quittet
• Direction : Séverine Chaumont-dubel
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2023
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : IGF - Institut de Génomique Fonctionnelle
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : NEUROPROTÉOMIQUE ET SIGNALISATION DES PATHOLOGIES CÉRÉBRALES

Mots clés

Mots clés libres

Développement neuronal

Cellules souches

Protéomique

Crispr-Cas9

Récepteurs couplés aux protéines G

Sérotonine

Neurodevelopment

Stem cells

Proteomics

Crispr-Cas9

G-Proetin coupled receptors

Serotonin

Résumé

Le récepteur de la sérotonine 5-HT6 est l'une des cibles les plus prometteuses pour traiter les déficits cognitifs liés à la schizophrénie, la maladie d'Alzheimer et les troubles autistiques. Notre équipe a démontré un rôle crucial du récepteur 5-HT6 dans certaines étapes du neurodéveloppement, incluant la migration, l'initiation de la pousse neuritique et la complexification de l'arborisation dendritique. Nous avons également démontré que ce récepteur est exprimé dans le cil primaire des neurones et des astrocytes, excepté pendant une période de 10 jours après la naissance, où il est retrouvé dans le compartiment somato-dendritique. L'inhibition pharmacologique du récepteur 5-HT6 pendant cette période provoque des déficits du comportement social chez la souris. Nous avons également montré que le récepteur 5-HT6 exprimé dans le cil primaire peut-être stimulé par la sérotonine des axones sérotonergiques voisins, formant un type inédit de synases, les synapses axo-ciliaires (Sheu et al, 2022, Cell 185, 3390-3407). Nos résultats montrent que la stimulation du récepteur induit une décompaction de la chromatine et une régulation des marques épigénétiques. Une étude protéomique dans le striatum de souris Knock-Out pour le récepteur 5-HT6 (Htr6-KO) montre une surexpression des histones H1, impliquées dans la compaction de la chromatine(données non publiées). Ce projet de thèse aura pour objectif de caractériser les processus neurodéveloppemementaux et épigénétiques contrôlés par le récepteur 5-HT6. Pour cela, nous utiliserons des modèles murins et un modèle de corticogenèse depuis des cellules souches embryonnaires (ESC) qui reproduit fidèlement le développement cortical in vivo. Nous combinerons des techniques CRISPR/Cas9 de modification génique, de protéomique et une approche multiomique. Ce projet comporte trois parties : - Pour déterminer le rôle du récepteur 5-HT6 et de sa localisation subcellulaire dans le neurodéveloppement, des lignées ESC gain de fonction permettant une expression inductible du récepteur 5-HT6 sauvage ou muté sur ses sites d'adressage au cil primaire et une lignée perte de fonction (Inhibition de l'expression du gène par CRISPRi) seront différenciées en organoïdes de cerveau. Le destin des cellules sera déterminé par RT-qPCR, immunofluorescence et RNA-seq. - Pour identifier les voies de signalisation associées au récepteur dans le cil primaire ou au niveau du corps cellulaire, nous ajouterons par CRISPR/Cas9 une étiquette TurboID-V5 en phase de lecture avec la séquence du récepteur 5-HT6. TurboID est une enzyme catalysant l'activation transitoire de la biotine par l'ATP. La biotine activée va marquer les protéines à proximité immédiate de la protéine portant l'étiquette (proximity labeling). Cette méthode, utilisée pour identifier les interactions protéines-protéines, nous permettra de décrypter les voies de signalisation associées au récepteur 5-HT6 impliquées spécifiquement dans la régulation de la structure de la chromatine et des marques épigénétiques. - Afin de relier le récepteur aux modifications de la chromatine et l'expression des gènes, nous combinerons des approches d'ATAC-Seq (régions de la chromatine accessibles pour la transcription), Cut and Run-seq (positionnement des histones sur l'ADN à l'échelle du génome), RRBS (méthylation de l'ADN) et RNA-seq (expression des gènes). Nous comparerons des organoïdes et des extraits striataux de souris sauvage (WT) et Htr6 KO. En parallèle, nous étudierons les marques épigénétiques des histones par une approche protéomique. Ce projet qui devrait mettre en lumière les relations entre récepteur ciliaire et expression des gènes au cours du neurodéveloppement sera réalisé à l'Institut de Génomique Fonctionnelle (IGF) sous la direction de Séverine Chaumont-Dubel, spécialiste du récepteur 5-HT6 dans le développement neuronal et responsable scientifique du plateau de protéomique fonctionnelle FPP et Tristan Bouschet, spécialiste de l'épigénétique et de la différenciation de cellules souches embryonnaires en organoïdes de cerveau.

The serotonin 5-HT6 receptor is one of the most promising targets for treating cognitive deficits associated with schizophrenia, Alzheimer's disease, and autistic disorders. Our team has demonstrated a crucial role for the 5-HT6 receptor in certain stages of neurodevelopment, including migration, initiation of neurite growth and dendritic arborization. We also demonstrated that this receptor is expressed in the primary cilium of neurons and astrocytes, except for a period of 10 days after birth, when it is found in the somatodendritic compartment. Pharmacological inhibition of the 5-HT6 receptor during this period causes deficits in social behavior in mice. We have also shown that the 5-HT6 receptor expressed in the primary cilium can be stimulated by serotonin from neighboring serotonergic axons, forming a novel type of synapse, axo-ciliary synapses (Sheu et al, 2022, Cell 185, 3390-3407). Our results show that receptor stimulation induces chromatin decompaction and regulation of epigenetic marks. A proteomic study in the striatum of Knock-Out mice for the 5-HT6 receptor (Htr6-KO) shows an overexpression of H1 histones, involved in chromatin compaction (unpublished data). This thesis project will aim to characterize the neurodevelopmental and epigenetic processes controlled by the 5-HT6 receptor. To do so, we will use mouse models and a model of corticogenesis from embryonic stem cells (ESC) that faithfully reproduces cortical development in vivo. We will combine CRISPR/Cas9 gene editing, proteomics and a multiomics approach. This project has three parts: - To determine the role of the 5-HT6 receptor and its subcellular localization in neurodevelopment, gain-of-function ESC lines allowing inducible expression of wild-type or mutated 5-HT6 receptor at its primary cilium addressing sites and a loss-of-function line (Inhibition of gene expression by CRISPRi) will be differentiated into brain organoids. Cell fate will be determined by RT-qPCR, immunofluorescence and RNA-seq. - To identify receptor-associated signaling pathways in the primary cilium or at the cell body level, we will CRISPR/Cas9 add a TurboID-V5 tag in read phase with the 5-HT6 receptor sequence. TurboID is an enzyme that catalyzes the transient activation of biotin by ATP. Activated biotin will label proteins near the tagged protein (proximity labeling). This method, used to identify protein-protein interactions, will allow us to decipher the signaling pathways associated with the 5-HT6 receptor specifically involved in the regulation of chromatin structure and epigenetic marks. - To link the receptor to chromatin modifications and gene expression, we will combine ATAC-Seq (chromatin regions accessible for transcription), Cut and Run-seq (genome-wide positioning of histones on DNA), RRBS (DNA methylation) and RNA-seq (gene expression) approaches. We will compare organoids and striatal extracts from wild type (WT) and Htr6 KO mice. In parallel, we will study histone epigenetic marks using a proteomic approach. This project, which should shed light on the relationships between ciliary receptor and gene expression during neurodevelopment, will be carried out at the Institute of Functional Genomics (IGF) under the direction of Séverine Chaumont-Dubel, specialist of the 5-HT6 receptor in neuronal development and scientific leader of the FPP functional proteomics platform, and Tristan Bouschet, specialist of epigenetics and of the differentiation of embryonic stem cells into brain organoids.