Etude et modulation de la polyadénylation des transcrits d'immunoglobulines au cours de la différenciation plasmocytaire

Study and modulation of polyadenylation of immunoglobulin transcripts during plasma cell differentiation

• Auteur / Autrice : Antoine Praite
• Direction : Laurent Delpy
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Chimie Santé mention Immunologie, oncologie, inflammation, infectiologie
• Date : Inscription en doctorat le 05/09/2023
• Etablissement(s) : Limoges
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Ω-LIM-Biologie-Chimie-Santé (Limoges ; 2022-)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Contrôle de la Réponse Immune B et Lymphoproliférations (Limoges ; 2018-....)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : CRIBL BioPIC - Biologie des Plasmocytes, Immunopathologie et Cancer

Mots clés

Mots clés libres

Polyadénylation

Myélome Multiple

Plasmocytes

Immunoglobulines

Arn

Polyadenylation

Multiple myeloma

Plasma cell

Immunoglobulin

Rna

Résumé

Contexte : A la fin de la transcription d'un gène par l'ARN polymérase II, l'ARN est clivé en 3' et une série de ribonucléotides de type adénosine (A) est ajoutée à la fin du transcrit formant la queue poly(A) afin de stabiliser le transcrit et d'empêcher sa dégradation. Ce mécanisme appelé polyadénylation est effectué grâce à des éléments en cis, le PAS (ou signal de polyadénylation) présente une séquence consensus AAUAAA ou des variants proches comme AUUAAA, et des régions l'entourant comme une région riche en U (UGUA) en amont et une région riche en U puis en GU en aval qui aident à la reconnaissance du PAS. Le clivage de l'ARN est réalisé à environ 20 nucléotides en aval du PAS, puis la poly(A) polymérase synthétise la queue poly(A) qui est rapidement complexée avec des protéines PAB (poly(A) binding proteins). Les queues poly(A) ont une taille variable d'en moyenne de 50 à 100 nucléotides. De nombreux gènes présentent plusieurs sites PAS générant des ARNm qui diffèrent au niveau de l'extrémité 3'. L'importance de la polyadénylation alternative (APA) dans la différenciation cellulaire a été démontrée pour la première fois lorsque Brown et Morrison ont signalé qu'un changement de la chaîne lourde des immunoglobulines (IgH) est déclenché par l'APA. En effet, la production de la forme sécrétée ou de la forme liée à la membrane des immunoglobulines (Ig) est réalisée par un changement de site poly(A). Alors que les cellules B utilisent le PAS distal pour produire une Ig membranaire ou BCR (B-cell receptor), les plasmocytes plus matures produisent des Ig sécrétées sous forme d'anticorps en utilisant un PAS proximal (situé en 5′). Une étude de Takagaki et collaborateurs a montré que la surexpression de la sous-unité CstF-64 (Cleavage Stimulating Factor-64) permettait un changement d'expression de l'IgM passant de sa forme membranaire à sa forme sécrétée tandis que l'expression de CstF-64 est constitutivement réprimée chez les cellules B où l'expression d'IgM membranaire est prépondérante. D'autre part, il a été récemment montré qu'une polyadénylation non classique par la poly(A) polymérase cytoplasmique TENT5C permettait de stabiliser les transcrits d'Ig et jouait un rôle au cours de la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes. En pathologie, plusieurs études ont rapporté des mutations de gènes impliqués dans la polyadénylation au cours du myélome multiple, un cancer du plasmocyte. Néanmoins, aucune étude n'a analysé de façon dynamique la polyadénylation des transcrits d'immunoglobulines au cours de la différenciation plasmocytaire normale et pathologique. Objectifs du projet : Au cours de ce projet nous proposons d'analyser finement la polyadénylation des transcrits d'immunoglobulines dans les lymphocytes B activés, les précurseurs de plasmocytes appelés plasmablastes et les plasmocytes à courte et longue durée de vie. Les expériences consisteront à déterminer la dynamique de l'APA des transcrits IgH au cours de ces étapes de maturation, et si des variations sont observées en fonction des isotypes d'Ig (i.e. IgM, IgG, IgA, IgE). En effet, certains plasmocytes IgM+ et IgA+ continuent d'exprimer un BCR contrairement aux plasmocytes IgG+, suggérant des différences d'APA jusqu'ici inexplorées. En complément de l'analyse des ARNm codant les formes sécrétées et membranaires des Ig, nous souhaitons déterminer les longueurs des queues poly(A) des transcrits d'Ig pour chaque sous population cellulaire. En parallèle, nous avons développé une stratégie consistant à utiliser des oligonucléotides antisens (ASO) pour masquer les séquences PAS des transcrits IgH codant les formes sécrétées ou membranaires des Ig (Brevet WO2020245182). Ces stratégies antisens orientent donc l'APA et permettent de moduler la sécrétion d'anticorps par les plasmocytes ou l'expression du BCR. Les résultats obtenus avec un ASO ciblant le site PAS des transcrits IgE sécrétés ont permis de diminuer la sécrétion d'IgE à des fins thérapeutiques dans l'allergie. De façon intéressante, nous avons montré que le couplage d'un peptide riche en arginine sur cet ASO pouvait diminuer la sécrétion d'IgE in vivo. Une collaboration est en cours avec l'équipe de Philippe Barthélémy (INSERM U1212/UMR CNRS 5320, ARNA, Bordeaux) pour développer des vectorisations par ajout d'un motif lipidique, afin de promouvoir l'utilisation thérapeutique de nos meilleurs ASOs. Une partie importante de cette étude sera également consacrée à l'étude d'ASO ciblant les sites PAS des Ig membranaires pour diminuer l'expression du BCR. En clinique, les approches antisens visant à diminuer l'expression du BCR pourraient bénéficier aux patients atteints de lymphomes B dont la survie dépend fréquemment de l'activation chronique du BCR. L'intérêt majeur de ces stratégies antisens ciblant spécifiquement un isotype d'Ig est de préserver en grande partie l'immunité humorale des patients.

At the end of transcription of a gene by RNA polymerase II, the RNA is cleaved 3' and a series of adenosine (A) ribonucleotides is added to the end of the transcript forming the poly(A) tail to stabilise the transcript and prevent its degradation. The PAS (or polyadenylation signal) has a consensus sequence AAUAAA or close variants such as AUUAAA, and surrounding regions such as an upstream U-rich region (UGUA) and a downstream region rich in U and then GU, which help to recognise the PAS. The RNA is cleaved about 20 nucleotides downstream of the PAS, and the poly(A) polymerase then synthesises the poly(A) tail, which is rapidly complexed with poly(A) binding proteins (PABs). Poly(A) tails vary in size from 50 to 100 nucleotides on average. Many genes have several PAS sites generating mRNAs that differ at the 3' end. The importance of alternative polyadenylation (APA) in cell differentiation was first demonstrated when Brown and Morrison reported that a change in the immunoglobulin heavy chain (IgH) is triggered by APA. The production of either the secreted or membrane-bound form of immunoglobulin (Ig) is achieved by a change of poly(A) site. Whereas B cells use the distal PAS to produce membrane-bound Ig or BCR (B-cell receptor), more mature plasma cells produce secreted Ig in antibody form using a proximal PAS (located at 5′). A study by Takagaki and colleagues showed that overexpression of the CstF-64 (Cleavage Stimulating Factor-64) subunit allowed a change in IgM expression from its membrane form to its secreted form, whereas CstF-64 expression is constitutively repressed in B cells where membrane IgM expression predominates. It has also recently been shown that non-classical polyadenylation by the cytoplasmic poly(A) polymerase TENT5C stabilises Ig transcripts and plays a role in the differentiation of B lymphocytes into plasma cells. In pathology, several studies have reported mutations in genes involved in polyadenylation during multiple myeloma, a plasma cell cancer. However, no study has dynamically analysed polyadenylation of immunoglobulin transcripts during normal and pathological plasma cell differentiation. Project objectives: In this project we propose to analyse in detail the polyadenylation of immunoglobulin transcripts in activated B lymphocytes, plasma cell precursors called plasmablasts and short- and long-lived plasma cells. The experiments will involve determining the dynamics of the APA of IgH transcripts during these maturation stages, and whether variations are observed according to Ig isotypes (i.e. IgM, IgG, IgA, IgE). Indeed, some IgM+ and IgA+ plasma cells continue to express a BCR unlike IgG+ plasma cells, suggesting hitherto unexplored differences in APA. In addition to analysing the mRNAs encoding the secreted and membrane forms of Ig, we wish to determine the lengths of the poly(A) tails of Ig transcripts for each cell subpopulation. In parallel, we have developed a strategy using antisense oligonucleotides (ASO) to mask the PAS sequences of IgH transcripts encoding secreted or membrane forms of Ig (Patent WO2020245182). These antisense strategies therefore direct the APA and make it possible to modulate antibody secretion by plasma cells or BCR expression. The results obtained with an ASO targeting the PAS site of secreted IgE transcripts have made it possible to reduce IgE secretion for therapeutic purposes in allergy. Interestingly, we have shown that coupling an arginine-rich peptide to this ASO can reduce IgE secretion in vivo. A collaboration is underway with Philippe Barthélémy's team (INSERM U1212/UMR CNRS 5320, ARNA, Bordeaux) to develop vectorisations by adding a lipid motif, in order to promote the therapeutic use of our best ASOs. A major part of this study will also be devoted to the investigation of ASOs targeting membrane Ig PAS sites to reduce BCR expression. In the clinic, antisense approaches aimed at reducing BCR expression could benefit B lymphoma patients whose survival frequently depends on chronic BCR activation. The major advantage of these antisense strategies specifically targeting an Ig isotype is that they largely preserve patients' humoral immunity.