Identification par Tn-Seq de nouveaux gènes et réseaux de régulation impliqués dans la biogenèse de la paroi chez Escherichia coli

Identification by Tn-Seq of new genes and regulatory networks involved in peptidoglycan biosynthesis in Escherichia coli

• Auteur / Autrice : Lisa Bal
• Direction : Thierry Touze
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : I2BC - Institut de Biologie Intégrative de la Cellule
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Faculté de pharmacie

Mots clés

Mots clés libres

Flippase

Undécaprényl phosphate

Membrane

Phosphatase

Peptidoglycane

Phosphatase

Undecaprenyl phosphate

Peptidoglycan

Flippase

Membrane

Résumé

Le peptidoglycane (PG) constitue l'exosquelette des bactéries et il leur est essentiel car il permet de résister à la pression osmotique interne et sa dynamique structurelle permet tout à la fois l'élongation et la division des bactéries. La synthèse du PG s'effectue sur la face externe de la membrane plasmique par polymérisation d'une sous-unité disaccharide-peptide catalysée par un ensemble de synthases dont les protéines de liaison à la pénicilline (PBPs), c.-à-d. les cibles des antibiotiques de type -lactamines. La sous-unité du PG est d'abord assemblée sur un lipide, l'undécaprényle phosphate (C55-P), du côté cytoplasmique de la membrane, donnant le précurseur nommé lipide II, qui est alors transloqué à travers la membrane permettant ainsi le transfert de la sous-unité au polymère en formation. Le transporteur lipidique est alors libéré sous forme d'undécaprényl pyrophosphate (C55-PP), qui doit être recyclé pour assurer une synthèse continue et à flux tendu de paroi (Figure). Par conséquent, ces étapes membranaires constituent un système fonctionnant en boucle fermée, appelé cycle du lipide II, dont le turnover est considéré comme déterminant pour assurer le bon déroulement de la biogenèse de la paroi cellulaire et l'homéostasie générale de l'enveloppe. Le PG représente le talon d'Achille des bactéries, comme le montre le fait qu'il soit la principale cible des agents antibactériens. Les -lactamines sont les antibiotiques les plus utilisés mais leur efficacité est aujourd'hui menacée par la croissance des phénomènes de multirésistance aux antibiotiques. Selon l'OMS, le groupe de pathogènes multirésistants le plus critique comprend les bactéries à Gram-négatif, telles que Escherichia coli, pour lesquelles il est urgent de développer de nouvelles stratégies antibactériennes. Une stratégie repose sur la potentialisation des lactamines par un autre antibiotique qui interférerait avec une autre étape du cycle du lipide II, comme le recyclage du C55-P. En accord avec cette hypothèse, il a été récemment montré que la réduction du taux de recyclage du C55-P, associée à l'inhibition des PBPs, engendrait une réponse synergique qui conduit à la lyse rapide cellulaire (Jorgenson et al. 2019 et 2020). Il est important de noter qu'une telle stratégie antibactérienne, reposant sur l'inhibition de deux processus interdépendants, devrait être moins sujette au développement de résistances. Le recyclage du C55-P nécessite 1) la déphosphorylation du C55-PP et 2) le retour du C55-P vers la face interne de la membrane. La première étape repose sur deux types de C55-PP phosphatases, BacA et PAP2 (par exemple, E. coli code une protéine BacA et trois PAP2 : PgpB, YbjG et LpxT). La délétion simultanée des gènes bacA, pgpB et ybjG est létale, alors que la présence d'un seul de ces gènes permet une croissance normale en condition de laboratoire, ce qui soulève la question de leurs rôles respectifs dans la biogenèse de la paroi (El ghachi et al., 2005). De même, la deuxième étape repose sur une multiplicité de flippases de la superfamille des protéines DedA (Roney and Rudner, 2022, Sit et al., 2022) et nous identifions actuellement l'ensemble des gènes dedA impliqués dans ce processus chez E. coli. Aussi, afin de cibler le recyclage du C55-P chez E. coli, nous devons comprendre la relevance de cette redondance des phosphatases et des flippases, notamment en étudiant les interconnections entre ces enzymes ainsi qu'avec les multiples synthases du PG et les autres protéines qui régulent de manière spatio-temporelle la biogenèse du PG. L'objectif de ce projet de thèse est donc d'élucider ces réseaux d'interaction complexes, impliquant un grand nombre d'acteurs, en utilisant une méthode génétique haut-débit basée sur de la mutagenèse par transposition combinée au séquençage des sites d'insertion du transposon (Tn-Seq). L'existence de multiples enzymes de recyclage du C55-P (phosphatases et flippases), avec des fonctions apparemment redondantes, rend difficile l'identification de ces réseaux de régulation ou d'interactions, car ces événements peuvent être non-essentiels en raison de la redondance des enzymes. Notre hypothèse est que, lors de l'inactivation de certaines enzymes de recyclage du C55-P, les phosphatases et/ou les flippases résiduelles deviennent essentielles ou plus importantes pour le fitness des cellules. Par conséquent, l'inactivation par le transposon des régulateurs ou des partenaires des enzymes résiduelles peut elle-même devenir létale (pour les partenaires obligatoires), altérer le fitness (partenaires non-obligatoires) ou, à l'inverse, augmenter le fitness (modulateurs négatifs). Par conséquent, le taux d'insertion du transposon dans ces gènes codant pour les partenaires diminuera (en raison d'une perte de viabilité ou de fitness) ou augmentera (en raison d'un gain de fitness) dans la souche mutante par rapport à la sauvage. Ces différences peuvent alors être identifiées par la méthode Tn-Seq. En bref, nous générerons des bibliothèques de mutants d'insertion de transposons dans des souches E. coli sauvage et mutantes exprimant différents ensembles de phosphatases et de flippases, ces bibliothèques seront criblées par croissance sur un milieu approprié, les sites d'insertion de transposons seront déterminés par séquençage Illumina et le taux d'insertion de transposons dans tous les gènes sera comparé statistiquement entre les différentes souches. Les interactions génétiques révélées par Tn-Seq seront ensuite validées et étudiées plus avant par des méthodes génétiques et biochimiques ciblées. Jorgenson MA, Bryant JC. A genetic screen to identify factors affected by undecaprenyl phosphate recycling uncovers novelconnections to morphogenesis in Escherichia coli. Mol Microbiol. 2021 Feb;115(2):191-207. doi: 10.1111/mmi.14609. Jorgenson MA, MacCain WJ, Meberg BM, Kannan S, Bryant JC, Young KD. Simultaneously inhibiting undecaprenyl phosphateproduction and peptidoglycan synthases promotes rapid lysis in Escherichia coli. Mol Microbiol. 2019 Jul;112(1):233-248. doi:10.1111/mmi.14265. El Ghachi M, Derbise A, Bouhss A, Mengin-Lecreulx D. Identification of multiple genes encoding membrane proteins with undecaprenylpyrophosphate phosphatase (UppP) activity in Escherichia coli. J Biol Chem. 2005 May 13;280(19):18689-95. doi:10.1074/jbc.M412277200. Roney IJ, Rudner DZ. Two broadly conserved families of polyprenyl-phosphate transporters. Nature. 2023 Jan;613(7945):729-734. doi:10.1038/s41586-022-05587-z. Sit B, Srisuknimit V, Bueno E, Zingl FG, Hullahalli K, Cava F, Waldor MK. Undecaprenyl phosphate translocases confer conditionalmicrobial fitness. Nature. 2023 Jan;613(7945):721-728. doi: 10.1038/s41586-022-05569-1.

Peptidoglycan (PG) constitutes the exoskeleton of almost all bacterial cells. PG is essential for viability by withstanding the internal osmotic pressure, yet, its structural dynamic supports cell elongation and division. PG synthesis occurs at the surface of the plasma membrane through the polymerization of a disaccharide-peptide subunit by a set of PG synthases including the Penicillin Binding Proteins (PBPs), i.e. the targets of -lactam antibiotics. The PG subunit is first assembled on a lipid, the undecaprenyl phosphate (C55-P), at the cytoplasmic side of the membrane, yielding lipid II intermediate, which is then flipped across the membrane to allow the final transfer of the subunit to the nascent polymer. The lipid carrier is released by PBPs as undecaprenyl pyrophosphate (C55-PP), which is recycled to fuel the high rate of cell wall synthesis (Figure). Consequently, the membrane steps of PG synthesis constitute a closed-loop system, called lipid II cycle, whose rate is considered as critical to ensure the proper turnover of cell wall biogenesis and the global homeostasis of the cell envelope. PG represents the Achilles heel of bacteria as underlined by the fact that it is the main target of antibacterial agents. -lactams are the most widely used antibiotics, whose effectiveness is now threatened by the rising of global antibiotics resistance. According to the WHO, the most critical group of multidrug resistant pathogens includes Gram-negative bacteria, such as Escherichia coli, to which it is urgent to develop new antibacterial strategies. One strategy relies on the potentiation of -lactams by an additional drug that would interfere with another close step of the lipid II cycle, such as C55-P recycling. In line with this hypothesis, it was recently shown that lowering the C55-P recycling rate together with PBPs inhibition provokes a synergistic response that rapidly leads to cell lysis (Jorgenson et al. 2019 and 2020). Importantly, such antibacterial strategy, relying on the inhibition of two interdependent processes, is expected to be less prone to the development of resistance. The recycling of C55-P requires 1) the dephosphorylation of C55-PP and 2) the flip of C55-P back to the inner side of the membrane. The first step relies on two types of C55-PP phosphatases, BacA and PAP2 (e.g. E. coli encodes one BacA and three PAP2s: PgpB, YbjG and LpxT). The simultaneous deletion of bacA, pgpB and ybjG genes was lethal, while the presence of a single of these genes provided a normal cell growth raising the question on their respective roles in cell wall biogenesis. Similarly, the second step also relies on a multiplicity of flippases of the DedA superfamily of proteins (Roney and Rudner, 2022, Sit et al., 2022) and we are currently identifying the set of dedA genes involved in this process in E. coli. In order to tackle C55-P recycling in E. coli, we must understand the relevance of this phosphatases/flippases redundancy, in particular by revealing the interplay between these enzymes as well as with the multiple PG synthases and other regulatory proteins that spatially and temporally control PG biogenesis. The objective of this thesis project is then to reveal complex interaction networks, involving a large number of players, by using a high-throughput transposon mutagenesis screen in combination with transposon insertion site sequencing (Tn-Seq). The existence of multiple C55-P recycling enzymes (i.e. phosphatases and flippases), with apparent redundant function, renders difficult the identification of regulatory networks or protein interplay, as these events may be none-essential due to redundancy. The rational of our project is that upon inactivation of certain C55-P recycling enzymes, the residual phosphatases or/and flippases may then become essential or more important for cellular fitness. Therefore, transposon inactivation of regulators or partners of the residual enzymes may itself become lethal (for obligate partners), alter fitness (non-obligate partners) or conversely increase fitness (negative modulators). Consequently, the rate of transposon insertion in these partners-encoding genes will either decrease (due to viability or fitness loss) or increase (due to gain of fitness) in the mutant strain as compared to the wild-type. These differences can then be identified by Tn-Seq. In short, we will 1) generate libraries of transposon insertion mutants in E.coli wild-type and mutant strains expressing different set of phosphatases and flippases, 2) screen the libraries by growth on appropriate medium, 3) determine the transposon insertion sites by Illumina sequencing and 4) statistically compare the rate of transposon insertion in all genes in the different genetic backgrounds. The genetic interactions revealed by Tn-Seq will then be validated and further investigated by more targeted genetic and biochemical methods. Jorgenson MA, Bryant JC. A genetic screen to identify factors affected by undecaprenyl phosphate recycling uncovers novelconnections to morphogenesis in Escherichia coli. Mol Microbiol. 2021 Feb;115(2):191-207. doi: 10.1111/mmi.14609. Jorgenson MA, MacCain WJ, Meberg BM, Kannan S, Bryant JC, Young KD. Simultaneously inhibiting undecaprenyl phosphateproduction and peptidoglycan synthases promotes rapid lysis in Escherichia coli. Mol Microbiol. 2019 Jul;112(1):233-248. doi:10.1111/mmi.14265. El Ghachi M, Derbise A, Bouhss A, Mengin-Lecreulx D. Identification of multiple genes encoding membrane proteins with undecaprenylpyrophosphate phosphatase (UppP) activity in Escherichia coli. J Biol Chem. 2005 May 13;280(19):18689-95. doi:10.1074/jbc.M412277200. Roney IJ, Rudner DZ. Two broadly conserved families of polyprenyl-phosphate transporters. Nature. 2023 Jan;613(7945):729-734. doi:10.1038/s41586-022-05587-z. Sit B, Srisuknimit V, Bueno E, Zingl FG, Hullahalli K, Cava F, Waldor MK. Undecaprenyl phosphate translocases confer conditionalmicrobial fitness. Nature. 2023 Jan;613(7945):721-728. doi: 10.1038/s41586-022-05569-1.