Optimisation des données PALM par des méthodes analytiques et optiques, et applications à la biologie cellulaire quantitative

Optimization of PALM data by analytical and optical methods, and application to quantitative cell biology.

• Auteur / Autrice : Abdelghani Neuhaus
• Direction : Jean-Baptiste Sibarita
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Bioimagerie
• Date : Inscription en doctorat le 01/09/2023
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Interdisciplinaire de Neurosciences
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Imagerie quantitative de la cellule

Mots clés

Mots clés libres

Apprentissage machine

Traitement d'images

Analyse d'images

Protéines fluorescentes photo-convertibles

Microscopie de super-résolution

Localisation de molécules uniques

Image processing

Machine learning

Data analysis

Super-resolution microscopy

Single molecule localization

Photo-convertible fluorescent proteins

Résumé

L'étude de l'organisation et de la dynamique des protéines dans leur contexte cellulaire natif fournit des informations précieuses sur leurs activités et leurs fonctions. Dans ce but, la technique de microscopie à super-résolution sptPALM (Single Protein Tracking combined with PhotoActivation Localization Microscopy) est une méthode idéale. Elle permet de d'étudier l'organisation et la dynamique de biomolécules dans leur environnement cellulaire natif, avec une résolution spatiale nanométrique et une résolution temporelle de l'ordre de la milliseconde. Malheureusement, la technique de sptPALM s'appuie généralement sur l'utilisation de protéines fluorescentes photoconvertibles codées génétiquement (PC-FP), dont les propriétés photophysiques limitent à la fois la résolution (précision de localisation) et la capacité à extraire des comportements dynamiques complexes (propriétés de diffusion transitoire). En effet, par rapport aux fluorophores organiques, les PC-FP ont un budget de photons réduit et des propriétés de « clignotement » complexes, limitant considérablement la précision de localisation et le suivi à long terme de molécules uniques. Ce projet de thèse vise à relever ces défis en développant des méthodes informatiques et optiques, dont les objectifs sont les suivants : (1) Déterminer les stratégies d'illumination et les paramètres d'acquisition optimaux pour améliorer les propriétés photophysiques de divers PC-FP, et plus particulièrement permettre l'enregistrement de trajectoires plus longues, (2) Développer des méthodes de débruitage basées sur l'apprentissage machine dédiées aux signaux de molécules uniques, dans le but d'améliorer encore plus la longueur des trajectoires et la fréquence d'acquisition, sans compromettre la précision de la localisation, (3) Développer des méthodes d'analyse avancées pour l'extraction de comportements dynamiques complexes, tels que les événements transitoires, à partir de longues trajectoires. Ce projet sera mené au sein de l'équipe 'Imagerie quantitative de la cellule', qui possède une expertise reconnue de longue date dans le domaine de la microscopie de localisation de molécules uniques (SMLM). Il s'appuiera notamment sur plusieurs outils existants développés dans l'équipe, tels qu'une plateforme d'acquisition automatisée de SMLM qui permet de collecter des données de molécules uniques dans de nombreuses conditions, ainsi que plusieurs outils analytiques dédiés à la quantification des données de SMLM. Ces développements seront ensuite utilisés pour répondre à des questions biologiques spécifiques en collaboration avec plusieurs équipes de biologie. En particulier, en collaboration avec le CBMN de Bordeaux, nous chercherons à étudier les comportements dynamiques du récepteur couplé aux protéines G Dopamine 2 (D2R) en fonction de la composition de la membrane cellulaire en acides gras polyinsaturés (AGPI).

Assessing protein organization and dynamics in their native cellular context provides invaluable insights into their activities and functions. In that goal, sptPALM (Single Protein Tracking combined with PhotoActivation Localization Microscopy) super-resolution microscopy technique is a method of choice. It allows gathering the nanoscale organization and dynamics of biomolecules in their native cellular environment with nanometric spatial resolution and millisecond temporal resolution. Unfortunately sptPALM usually relies on genetically encoded photoconvertible fluorescent proteins (PC-FP), which photophysical properties limit both the resolution (localization accuracy) and the ability to extract complex dynamic behaviors (transient diffusion properties). Indeed, compared to organic fluorophores, PC-FP have limited photon budget and complex blinking behaviors, precluding the accurate localization and long-term tracking of single molecules. This PhD project aims to address those challenges by developing computational and optical methods, with the following goals: (1) Determine optimal illumination strategies and acquisition parameters to improve the photophysical properties of various PC-FP, and more particularly enable longer trajectories to be recorded, (2) Develop machine learning-based denoising methods dedicated to single molecules signals in order to further improve the trajectory length and acquisition frequency, without compromising the localization accuracy, (3) Develop advanced analysis methods for the extraction of complex dynamical behaviors, such as transient events, from long trajectories. This project will be conducted in the team Quantitative Imaging of the Cell, which has a long lasting recognized expertise in Single Molecule Localization Microscopy (SMLM). It will rely on several existing tools developed in the team such as an automatized SMLM acquisition platform that allows collecting SM data of many conditions in a single workflow, as well several analytical tools dedicated to SMLM data quantification. Those developments will then be used to address specific biological questions in collaboration with several biology teams. In particular, in collaboration with the CBMN in Bordeaux, we will seek to explore the dynamical behaviors of the G protein-coupled receptor Dopamine 2 (D2R) according to the composition of the cell membrane in polyunsaturated fatty acids (PUFA). 1. Beghin, A. et al. Localization-based super-resolution imaging meets high-content screening. Nat. Methods 14, 1184–1190 (2017). 2. Butler, C. et al. Multi-Dimensional Spectral Single Molecule Localization Microscopy. Front. Bioinforma. 2, 813494 (2022). 3. Levet, F. et al. SR-Tesseler: a method to segment and quantify localization-based super-resolution microscopy data. Nat. Methods 12, 1–9 (2015).