Caractérisation par RMN du liquide de la machinerie protéolytique ClpXP

Structural investigations of ClpX/ClpP proteolytic machinery in action

• Auteur / Autrice : Astrid Audibert
• Direction : Jérôme Boisbouvier
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Structurale et Nanobiologie
• Date : Inscription en doctorat le 01/09/2022
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Biologie Structurale

Mots clés

Mots clés libres

Machines supramoléculaires

AAA+ ATPase

Synthèse acéllulaire

Cryo-EM

Rmn

Protéolyse

Proteolysis

Supramolecular machines

AAA+ ATPase

Cryo-EM

Cell-free synthesis

Nmr

Résumé

La protéase caseinolytique (Clp) est un modèle courant de machinerie protéolytique supramoléculaire. Elle est présente dans tous les règnes du vivant, des bactéries aux mitochondries des eucaryotes. Elle y joue un rôle crucial dans la régulation du protéome, notamment dans le développement de la virulence chez les bactéries pathogènes. C'est pourquoi, Clp est devenue une cible privilégiée pour le développement de nouveaux traitements contre les bactéries multirésistantes. De plus, son rôle de maintien de l'homéostasie mitochondriale, en particulier en cas de stress cellulaire, en fait aussi une bonne cible de traitement antitumoral. Clp est composé d'un assemblage de deux types de protéines, une unité protéasique, ClpP, associée à une unité de dérepliement des protéines cibles, ClpX. ClpPs est un large tonneau composé de 2 anneaux, de 7 ClpP serine protéases, se faisant face. La taille totale du 14-mer est de 300 kDa. CLpX qu'en a lui, forme des anneaux de seulement 6 unités qui consomment de l'ATP affin de déplier la protéine cliente et de la faire glisser dans la chambre de dégradation du tonneau de ClpPs, via son ouverture. Les anneaux ClpX peuvent se positionner de part et d'autre du tonneau ClpP et ainsi former un complexe ClpP/X de 26 sous-unités ayant une taille de 850 kDa. Ses dernières années, d'importantes avancées technologiques ont considérablement augmenté la résolution de la cryo-microscopie électronique. Ces avancées ont permis l'obtention des premières structures du complexe ClpP/X en présence d'un peptide substrat (1-3). Bien que la cryo-EM et la cristallographie par rayons X aient permis d'obtenir de telles structures, ces méthodes de biologie structurale ne donnent accès qu'à des images statiques du complexe et ne donnent que peu d'informations sur la cinétique des réactions et la dynamique du complexe. Informations pourtant nécessaires à la fine compréhension du mécanisme de dégradation à l'échelle atomique. Ce manque d'informations laisse de nombreuses questions en suspens. Par exemple, quels sont les bases structurales de la reconnaissance des protéines substrat par ClpX ? Comment ClpX et ClpP se reconnaissent et interagissent ensemble malgré l'asymétrie structurale des deux types d'anneaux ? Quels sont les différentes étapes du cycle de dérepliment et de dégradation des substrats par ClpP/X ? Quels est la cinétique de ses étapes et leur état intermédiaires ? L'objectif de cette thèse est de comprendre le mécanisme de dégradation par ClpP/X en obtenant des informations structurales précises et des données de cinétique du mécanisme de cette machinerie protéolytique directement au cours son activité de dégradation du substrat grâce à l'énergie fourni par l'ATP. Durant la thèse, le doctorant combinera des méthodes de pointes en Résonance Magnétique Nucléaire de très hauts champs et en cryo-microscopie électronique. La spectroscopie RMN liquide est nécessaire à l'étude d'un si large complexe, en particulier pour l'étudier dans des conditions compatibles avec son fonctionnement au sein du spectromètre. Les résultats de RMN seront combinés à ceux obtenus par cryo-EM afin d'avoir des modèles haute définition des états intermédiaires du cycle de dégradation d'un substrat en présence d'ATP. Cette approche combinant plusieurs méthodes de biologie structurale offre une unique possibilité d'étudier, à l'échelle atomique, le mécanisme de la machine supramoléculaire ClpP/X au cœur de son fonctionnement. Le doctorant sera formé aux dernières méthodes de RMN en solution conçues par l'équipe d'accueil (4-5), technique permettant d'étudier le cycle fonctionnel du complexe substrat/machine large d'1 MDa. Pour étudier la machine protéolytique ClpP/X en train de dégrader son substrat, le doctorant utilisera un système de régénération de l'ATP directement à l'intérieur du tube de spectrométrie RMN afin de pouvoir maintenir la concentration en ATP constante et de maintenir l'activité de ClpP/X (6). L'aboutissement de ce projet permettra de comprendre en détail le mécanisme de ce complexe clé dans l'homéostasie cellulaire. Références : 1. Gatsogiannis, Balogh, Merino, Sieber, Raunser. “Cryo-EM structure of the ClpX/P protein degradation machinery”. Nature Structural and Molecular Biology (2019). DOI: 10.1038/s41594-019-0304-0. 2. Ripstein, Vahidi, Houry, Rubinstein, Kay. “A processive rotary mechanism couples substrate unfolding and proteolysisin the ClpXP degradation machinery”. eLife (2020). DOI: 10.7554/eLife.52158. 3. Fei, Bell, Jenni, Stinson, Baker, Harrison, Sauer. “Structures of the ATP fueled ClpXP proteolytic machine bound to protein substrate”. eLife (2020). DOI: 10.7554/eLife.52774. 4. Amero, Schanda, Dura, Ayala, Marion, Franzetti, Brutscher, Boisbouvier. “Fast Two Dimensional NMR Spectroscopy of High Molecular Weight Protein Assemblies”. Journal of the American Chemical Society (2009). doi: 10.1016/j.sbi.2015.03.009. 5. Kerfah, Plevin, Sounier, Gans, Boisbouvier. “Methyl Specific Isotopic Labeling: A Molecular Tool Box for NMR Studies of Large Proteins“. Current Opinion in Structural Biology (2015). doi: 10.1016/j.sbi.2015.03.009. 6. Mas, Guan, Crublet, Colas Debled, Moriscot, Gans, Schoehn, Macek, Schanda, Boisbouvier. “Structural Investigation of a Chaperonin in Action Reveals How Nucleotide Binding Regulates the Functional Cycle“. Science Advances (2018). doi: 10.1126/sciadv.aau4196.

The caseinolytic protease (Clp) system is a paradigmatic case of a protease machinery, present in bacteria and most eukaryotes. Clp proteins play an active role in survival and virulence of pathogenic bacteria. Therefore, the development of drugs targeting the main protease of Clp system (ClpP) has recently emerged as a promising strategy to address multiresistant bacteria. Furthermore, indications that mitochondrial ClpP expression is induced in response to cellular stress, e.g. as a consequence of tumor genesis, highlight the importance of ClpP proteases in eukaryotic protein homeostasis. In the ClpP/X system, the ClpP protease enzyme unit is associated with an auxiliary ATPase (ClpX). ClpPs are large cylindrical serine proteases formed by two head-to-head stacked heptameric rings with a total molecular weight of ca. 300 kDa for the 14-mer. ClpX forms hexameric ring-structures capable of unfolding client proteins in an ATP-dependent manner by threading the polypeptide chain through its central pore and translocate unfolded chains into the chamber of ClpP protease assembly. Hexameric rings of ClpX are able to bind on both side of ClpP 14 mer, forming a 26 subunits proteolytic machine of ca. 850 kDa. During the last years, advances in cryogenic electron microscopy (cryo-EM) have enabled the determination of the first structures of ClpP/X machine (1-3). While cryo-EM and X-ray crystallography technics enable the structure determination of such large protein complexes, these structural biology methods provide only a static picture of the system and rarely report the kinetic data necessary for a full understanding of the mode of action at an atomic resolution. A myriad of fundamental questions on ClpP/X mechanism remains unanswered, such as: What is the structural basis for ClpX/client recognition? How ClpX and ClpP rings recognize each other despite the symmetry mismatch? What is the dynamics of ClpP/X subunit binding and release, when the machine is fueled by ATP? What are the mechanisms by which client proteins are unfolded and transferred through ClpX and ClpP pores? What are the different steps of client protein unfolding, transfer, degradation by the active ClpP/X machine? What are the kinetics for each step and structures of different intermediates of ClpP/X functional cycle? The objective of this PhD project is to understand the mechanism of the ClpP/X machine, by obtaining detailed structural insights and kinetic information on the mechanisms of these ATP-fueled proteolytic machinery under functional conditions. In this project, the PhD student will integrate state of the art high-field Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and Cryo Electron microscopy methods. Solution NMR spectroscopy will be used to observe such large machinery while it is processing substrate proteins. These results will be combined with cryoEM studies, in order to obtain high resolution structural models of various intermediate states of ClpP/X functional cycle in presence of ATP and in interaction with client protein. This integrated structural biology approach will offer a unique opportunity to study, at atomic resolution, the structure and the mechanism of dynamics ClpP/X molecular machine in the heat of action. To achieve these goals, the PhD student will be trained to innovative solution NMR methods (4-5) developed by host team, enabling the study of functional chaperone/client protein complexes with molecular as high as 1 MDa using solution state NMR (6). To study ClpP/X proteolytic assembly, while the complex is processing its client protein, the student will use an in house developed ATP regeneration system directly inside a NMR tube to maintain constant the ATP concentration (6), allowing to keep the ClpP/X machine in working condition (powered by ATP hydrolysis) during NMR data acquisition. With this project, the PhD student will significantly contribute to the understanding of the basic mechanism of this key player of cell homeostasis. References : 1. Gatsogiannis, Balogh, Merino, Sieber, Raunser. “Cryo-EM structure of the ClpX/P protein degradation machinery”. Nature Structural and Molecular Biology (2019). DOI: 10.1038/s41594-019-0304-0. 2. Ripstein, Vahidi, Houry, Rubinstein, Kay. “A processive rotary mechanism couples substrate unfolding and proteolysisin the ClpXP degradation machinery”. eLife (2020). DOI: 10.7554/eLife.52158. 3. Fei, Bell, Jenni, Stinson, Baker, Harrison, Sauer. “Structures of the ATP fueled ClpXP proteolytic machine bound to protein substrate”. eLife (2020). DOI: 10.7554/eLife.52774. 4. Amero, Schanda, Dura, Ayala, Marion, Franzetti, Brutscher, Boisbouvier. “Fast Two Dimensional NMR Spectroscopy of High Molecular Weight Protein Assemblies”. Journal of the American Chemical Society (2009). doi: 10.1016/j.sbi.2015.03.009. 5. Kerfah, Plevin, Sounier, Gans, Boisbouvier. “Methyl Specific Isotopic Labeling: A Molecular Tool Box for NMR Studies of Large Proteins“. Current Opinion in Structural Biology (2015). doi: 10.1016/j.sbi.2015.03.009. 6. Mas, Guan, Crublet, Colas Debled, Moriscot, Gans, Schoehn, Macek, Schanda, Boisbouvier. “Structural Investigation of a Chaperonin in Action Reveals How Nucleotide Binding Regulates the Functional Cycle“. Science Advances (2018). doi: 10.1126/sciadv.aau4196.