Rôle des canaux TREK1 centraux et périphériques dans la nociception et le prurit

Role of central and peripheral TREK1 channels in nociception and pruritus

• Auteur / Autrice : Romane Boyer
• Direction : Stephane Lolignier
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie santé
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2021
• Etablissement(s) : Université Clermont Auvergne (2021-...)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences de la Vie, Santé, Agronomie, Environnement
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : NEURO-DOL

Mots clés

Mots clés libres

Trek1

Canal ionique

Douleur

Prurit

Trek1

Ion channel

Pain

Pruritus

Résumé

La morphine est un opioïde antalgique puissant, mais dont l'effet anti-douleur est largement contrebalancé par des effets indésirables délétères. Ces derniers peuvent être un obstacle à une prise en charge correcte de la douleur (dépression respiratoire dose-limitante, tolérance) et impacter négativement la qualité de vie des patients (constipation, nausées, sédation). La dépendance induite par les médicaments opioïdes est de plus à l'origine d'une crise sanitaire touchant plusieurs pays industrialisés dont la France. Il est donc urgent de proposer des alternatives pharmacologiques aux opioïdes avec un ratio bénéfice/risque amélioré. Notre équipe a précédemment démontré le rôle du canal potassique TREK-1 dans la douleur polymodale [1]. De plus, son activation en aval du récepteur µ opioïdergique est responsable de l'antalgie induite par la morphine sans participer à ses effets indésirables [2]. De même, la spadine, un inibiteur de TREK-1 bloque l'effet antalgique de la morphine chez des souris wild-type [3]. Le riluzole, un activateur non spécifique de TREK-1 montre aussi de bonnes propriétés antalgiques qui sont perdues chez les souris TREK-1 KO [4]. Enfin la preuve de concept la plus importante est apportée par le RNE28, une molécule designée et caractérisée à travers une colaboration avec l'Institut de Chimie de Clermont-Ferrand. Le RNE28 montre de bonnes propriétés antalgiques chez des souris naives et des moodèles iflammatoire et neuropathique [3]. Cet effet est médié par TREK-1, comme montré par l'utilisation de souris TREK-1 KO et de la spadine. Le RNE28 n'induit pas de dépression respiratoire, de constipation, de sédation ou de dépedance. Même si ce composé ne pourra pas aboutir à la synthèse d'un médicament (EC 50 élevé, accepteur de Michael), ce travail constitue une preuve de la possibilité d'isoler les effets bénéfiques de la morphine de ses effets indésirables grâce à l'activation directe de TREK-1. Récemment, d'autres équipes ont aussi reporté un effet atalgique induit par des activateurs de TREK-1 sur des modèles inflammatoire et neuropathique [5] et de migraine [6], renforcant ainsi la validité de la cible. Aujourd'hui, malgré l'accumulation de preuves concernant l'effet antalgique médié par TREK-1, on ne sait pas si ce sont les canaux TREK-1 exprimés dans le système enrveux central (SNC) ou périphérique (SNP) ou les deux qui sont impliqués dans cet effet antalgique. Or, c'est un élément fondalementalement important pour la compréhesion de la douleur et crucial pour le design et l'évaluation de futurs médicaments antalgiques. Il est donc prévu d'étudier l'expression de TREK-1 dans le SNC et SNP, d'évaluer l'effet de l'activation de TREK-1 dans les neurones centraux et périphériques, et d'étudier l'activité antalgique d'activateurs de TREK-1 chez des souris où TREK-1 est totalement délété ou uniquement au niveau des DRG (ganglion de la racine dorsale de la moelle épinière : SNP). Certains aspects de ce travail s'appuient sur un outil génétique : une souris knock-in (KI) TREK-1V5-P2A-CreERT2. 1. Expression de TREK-1 dans les neurones périphériques sensoriels et centraux Nous aimerions clarifier le pattern d'expression de TREK-1 dans le système nerveux (DRG, moelle épinière et différentes régions du cerveau). 2. Effet de l'activation de TREK-1 sur le SNC et SNP Premièrement, nous aimerions explorer la contribution de TREK-1 et l'effet de son activation sur la réponse des neurones sensoriels périphériques à différents stimuli physicochimiques connus pour activer différentes populations neuronales. - De l'imagerie calcique sur des cultures de neurones de DRG sera utilisée pour étudier l'effet de l'activation de TREK-1 sur les réponses neuronales à des stimuli mécanique (osmotique), thermique (chaud, froid), chimique (capsaïcine, menthol et soupe inflammatoire). Nous regarderons comment la délétion de TREK-1 affecte la réponse neuronale et l'effet de l'activation de TREK-1 sur ces réponses. - Pour confirmer les données d'imagerie calcique avec des enregistrements électrophysiologiques dans un contexte plus physiologique, les enregistrements ex vivo nerf peau seront effectués sur des souris WT et TREK-1 KO. La peau de la patte arrière sera exposée au même activateur de TREK-1 (ou véhicule) avant et après application de stimuli mécanique (Von Frey), thermique (chaleur ou froid) et chimique (soupe inflammatoire) pendant que les potentiels d'actions des fibres provenant du nerf saphène seront enregistrés. Ensuite, nous explorerons les conséquences de l'activation de TREK-1 dans le système nerveux central : - De l'imagerie calcique pourra aussi être effectuée sur des tranches de moelle épinière de souris TREK-1 KO vs WT, après stimulation électrique des racines dorales, avant et après perfusion d'un activateur de TREK-1 (même design que pour l'imagerie calcique sur neurones de DRG). 3. Contribution des neurones TREK-1 périphériques et centraux à l'antalgie induite par des activateurs de TREK-1 in vivo L'implication des canaux TREK-1 périphériques et centraux sera étudiée par l'évaluation de la nociception et de la douleur respectivement chez des souris naives et un modèle de douleur inflammatoire, par des tests mécanique et thermique (respectivement Von Frey et Hargreaves). Deux stratégies seront employées: pharmacologie et génétique. - Plusieurs activateurs de TREK-1 seront utilisés et injectés par voie systémique et centrale chez des souris WT. - Pour s'affranchir des biais pharmacologiques potentiels, des souris WT, TREK-1 KO et TREK-1 KO conditionnel (KO resteint aux neurones sensitifs donc au SNP) seront utilisées.

Morphine is a powerful analgesic opioid, but its pain-relieving effect is largely offset by deleterious side effects. These can hinder proper pain management (dose-limiting respiratory depression, tolerance) and have a negative impact on patients' quality of life (constipation, nausea, sedation). Opioid-induced dependence is also at the root of a health crisis affecting several industrialized countries, including France. It is therefore urgent to propose pharmacological alternatives to opioids with an improved benefit/risk ratio. Our team has previously demonstrated the role of the TREK-1 potassium channel in polymodal pain [1]. Moreover, its activation downstream of the µ-opioid receptor is responsible for morphine-induced analgesia without contributing to its adverse effects [2]. Similarly, spadine, a TREK-1 inibitor, blocks the analgesic effect of morphine in wild-type mice [3]. Riluzole, an on-specific TREK-1 activator, also shows good analgesic properties, which are lost in TREK-1 KO mice [4]. Finally, the most important proof of concept is provided by RNE28, a molecule designed and characterized in collaboration with the Institut de Chimie de Clermont-Ferrand. RNE28 shows good analgesic properties in naive mice and in iflammatory and neuropathic moodeles [3]. This effect is mediated by TREK-1, as shown by the use of TREK-1 KO mice and spadine. RNE28 does not induce respiratory depression, constipation, sedation or depedation. Although this compound will not lead to the synthesis of a drug (high EC 50, Michael acceptor), this work constitutes proof of the possibility of isolating the beneficial effects of morphine from its undesirable effects through direct activation of TREK-1. Recently, other teams have also reported an atalgesic effect induced by TREK-1 activators in inflammatory and neuropathic models [5] and migraine [6], reinforcing the validity of the target. Today, despite accumulating evidence of TREK-1-mediated analgesic effect, it remains unclear whether TREK-1 channels expressed in the central nervous system (CNS) or peripheral nervous system (PNS), or both, are involved in this analgesic effect. This is a fundamentally important element for understanding pain, and crucial for the design and evaluation of future analgesic drugs. It is therefore planned to study TREK-1 expression in the CNS and SNP, to assess the effect of TREK-1 activation in central and peripheral neurons, and to study the analgesic activity of TREK-1 activators in mice in which TREK-1 is totally deleted or only at DRG level (dorsal root ganglion of the spinal cord: SNP). Some aspects of this work are based on a genetic tool: a TREK-1V5-P2A-CreERT2 knock-in (KI) mouse. 1. TREK-1 expression in peripheral sensory and central neurons We would like to clarify the expression pattern of TREK-1 in the nervous system (DRG, spinal cord and different brain regions). 2. Effect of TREK-1 activation on the CNS and PNS First, we would like to explore the contribution of TREK-1 and the effect of its activation on the response of peripheral sensory neurons to different physicochemical stimuli known to activate different neuronal populations. - Calcium imaging on DRG neuron cultures will be used to study the effect of TREK-1 activation on neuronal responses to mechanical (osmotic), thermal (hot, cold), chemical (capsaicin, menthol and inflammatory soup) stimuli. We will examine how TREK-1 deletion affects neuronal responses and the effect of TREK-1 activation on these responses. To confirm calcium imaging data with electrophysiological recordings in a more physiological context, ex vivo nerve skin recordings will be performed on WT and TREK-1 KO mice. The skin of the hind paw will be exposed to the same TREK-1 activator (or vehicle) before and after application of mechanical (Von Frey), thermal (heat or cold) and chemical (inflammatory soup) stimuli, while the action potentials of fibers originating from the saphenous nerve will be recorded. We will then explore the consequences of TREK-1 activation in the central nervous system: - Calcium imaging can also be performed on spinal cord slices from TREK-1 KO vs. WT mice, after electrical stimulation of the dorsal roots, before and after infusion of a TREK-1 activator (same design as for calcium imaging on DRG neurons). 3. Contribution of peripheral and central TREK-1 neurons to TREK-1 activator-induced antalgia in vivo The involvement of peripheral and central TREK-1 channels will be investigated by assessing nociception and pain in naive mice and an inflammatory pain model, respectively, using mechanical and thermal tests (Von Frey and Hargreaves, respectively). Two strategies will be employed: pharmacology and genetics. - Several TREK-1 activators will be used and injected systemically and centrally into WT mice. - To avoid potential pharmacological biases, WT, TREK-1 KO and conditional TREK-1 KO mice (KO remainsint to sensory neurons and therefore to the SNP) will be used.