Validation d'un analogue fluorescent isomorphe de la Guanine comme outil d'étude de la structure et de la dynamique des G-quadruplexes

Validation of an isomorphic fluorescent analogue of Guanine as a tool to study the structure and dynamics of G-quadruplex

• Auteur / Autrice : Constanza Avendano avila
• Direction : Brahim Heddi
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biochimie et biologie structurale
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2022
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : LBPA - Laboratoire de Biologie et Pharmacologie Appliquée
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Structures et Interactions des Acides Nucléiques
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Ecole Normale Supérieure Paris-Saclay

Mots clés

Mots clés libres

G-quadruplex

Arn

Rmn

Fluorescence

G-quadruplex

Rna

Nmr

Fluorescence

Résumé

Les G-quadruplexes (G4) sont des structures d'acides nucléiques formant une structure secondaire particulière. Ces structures d'acides nucléiques sont formées par des empilements de plateaux de tétrades de G (G-tétrades) stabilisées par la présence de contres-ions. Chaque G-tétrade est formée par l'association de quatre guanines liées par des liaisons hydrogènes de type Hoogsteen et est stabilisée par un cation. Les séquences formant les GQ sont largement distribuées dans les ARNm et les ARN non codants, où elles régulent l'expression des gènes. In vivo, on pense que les ARN GQ sont largement dépliés, en raison de l'activité des protéines de liaison à l'ARN (RBP). Par conséquent, les ARN GQ sont probablement des structures transitoires converties par les RBP entre leurs états replié et déplié. Les techniques de fluorescence sont bien adaptées à l'exploration de leur structure, de leur dynamique et de leur interaction avec les protéines, sur une large gamme de temps et à de faible concentration, mais elles souffrent de la nécessité d'introduire des marqueurs externes. De nombreux substituts de guanine fluorescentes ont été développés, mais ils déstabilisent généralement la structure des GQ ou leur fluorescence est « quenche ». Dans ce contexte, notre objectif est de valider et d'appliquer un analogue fluorescent isomorphe de la guanine développée par notre collaborateur comme un outil unique pour caractériser de manière spécifique les conformations, la dynamique et les interactions moléculaires des GQs d'ARN. Nous caractériserons d'abord l'effet de la guanine analogue sur la topologie et la stabilité des GQs : Dichroïsme circulaire, et expériences de RMN. Pour les séquences avec des spectres RMN bien résolus, la structure 3D sera ensuite déterminée, afin d'obtenir des détails structurels fins de l'impact de l'insertion de la guanine analogue dans les structures GQ. Nous validerons le tzG comme un outil clé pour les GQs d'ARN en l'appliquant pour déchiffrer le mécanisme de dépliage des GQs par les protéines DHX36 et CNBP, par une combinaison de CD et de RMN tandis que notre collaborateur utilisera la spectroscopie de fluorescence et le « stopped-flow ». Le projet rassemble un consortium international multidisciplinaire d'experts reconnus dans leurs domaines respectifs, notamment la chimie de synthèse, la fluorescence et la simulation à l'aide d'approches MD/QM. Grâce à cette étude de, la guanine analogue devrait devenir le premier outil capable de sonder l'ARN GQ et ainsi, conduire à des percées dans la compréhension des propriétés des GQ et des mécanismes d'action des RBP.

G quadruplexes (GQs) are non-canonical nucleic acid structures that consist of at least two layers of G quartets held together by stacking interactions, Hoogsteen bonds and cation binding. GQ forming sequences are widely distributed in mRNAs and non-coding RNAs, where they regulate gene expression. In vivo, RNA GQs are thought to be largely unfolded, due to the activity of RNA binding proteins (RBP). Therefore, RNA GQs are probably transient structures converted by RBPs between their folded and unfolded states. Fluorescence techniques are well-suited to explore their structure and dynamics as well as their interaction with proteins on a wide time range and at low concentration, but suffering from the need of introducing external labels. Numerous fluorescent purine surrogates have been developed, but they generally destabilize the GQ structure or are highly quenched. In this context, our objective is to validate and apply tzG, an isomorphic fluorescent analogue of G from the isothiazolo[4,3-d]-pyrimidine family developed by our collaborator as a unique tool to site-specifically characterize the conformations, dynamics and molecular interactions of RNA GQs. We will fisrt characterized the effect of tzG on GQ topology and stability CD, thermal melting experiments and NMR experiments. For sequences with well-resolved NMR spectra, the 3D structure will be then determined, to obtain fine structural details of the impact of tzG insertion in GQ structures. We will validate tzG as a key tool for RNA GQs by applying it to decipher the GQ unfolding mechanism of DHX36 and CNBP proteins, through a combination of CD and NMR while our collaborator will use fluorescence spectroscopy and stopped-flow technique. We expect to monitor site specifically the initial and late events of the unfolding/refolding mechanism.The project gathered an international multidisciplinary consortium of recognized experts in their fields, including synthetic chemistry, fluorescence and simulation using MD/QM approaches. Through this study, tzG should become the first tool that can faithfully monitor any substituted G in RNA GQs and thus, lead to breakthroughs in the understanding of GQ properties and RBP mechanisms of action.