Thèse en cours

Évolution dirigée d'enzymes à très haut débit à l'aide de présentation à molécule unique
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Auteur / Autrice : Maria Galiarnyk
Direction : Yannick RondelezGuillaume Gines
Type : Projet de thèse
Discipline(s) : Biologie moléculaire
Date : Inscription en doctorat le 17/10/2022
Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : GULLIVER
établissement opérateur d'inscription : ESPCI Ecole supérieure de physique et de chimie industrielles de la ville de Paris (PSL)

Résumé

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Les méthodes in vitro existantes d'évolution à très haut débit d'enzymes sont basées sur le tri de microgouttes qui contiennent chacune un variant génétique différent ainsi que de multiples copies de l'enzyme correspondante. L'obtention de cette co-compartimentation génotype/phénotype est le point critique de la méthode, permettant la sélection de variants génétiques correspondant à des propriétés phénotypiques améliorées. Pour ce faire, il est généralement nécessaire d'accumuler de nombreuses copies d'une même enzyme dans la goutte, car un signal phénotypique fort est nécessaire pour l'étape de sélection. En revanche, l'évolution dirigée de protéines non catalytiques, par exemple l'optimisation de liants spécifiques similaires aux anticorps, peut se faire directement sur une seule copie du variant protéique, à condition que la protéine soit chimiquement liée à son gène codant. En effet, la propriété recherchée, la liaison, permet d'extraire directement le liant par affinité d'un pool d'autres variants moins performants, et ainsi de récupérer des gènes prometteurs. Ce format « présentation en molécule unique » permet des protocoles de sélection beaucoup plus simples, qui se traduisent à leur tour par un nombre beaucoup plus grand de variants pouvant être testés et, finalement, par des protocoles d'évolution dirigée plus efficaces. Dans ce projet, nous démontrerons la sélection enzymatique directement à partir de l'activité catalytique de paires gène-enzyme uniques, produits en utilisant la « présentation en molécule unique». Pour détecter et amplifier l'activité catalytique infime fournie par ces enzymes uniques, nous utiliserons des réseaux moléculaires programmables avec les propriétés suivantes : 1- ils peuvent être conçus pour détecter une variété d'entrées moléculaires, qui peuvent être le produit de diverses activités enzymatiques d'intérêt ; 2- ils peuvent être ajustés pour avoir des réponses ultrasensibles, et ainsi détecter un niveau d'activité enzymatique extrêmement faible, jusqu'à des niveaux d'enzymes pico- ou femtomolaires ; 3- ils peuvent amplifier le signal moléculaire et produire une réponse macroscopique permettant la sélection des gènes codant pour des enzymes intéressantes. Après avoir démontré l'approche sur une enzyme de restriction modèle, le projet se concentrera sur l'élargissement de l'approche à une variété d'activités, en se concentrant en particulier sur l'amélioration d'enzymes avec des applications biotechnologiques et/ou biomédicales utiles.