Etude des interactions entre cellules tumorales et cellules du microenvironnement pour la compréhension de l'écosystème tumoral du neuroblastome

Exploring the interactions of tumor cells with the microenvironment to understand the neuroblastoma ecosystem

• Auteur / Autrice : Eva Galateau
• Direction : Isabelle Janoueix- lerosey
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Sciences du Cancer
• Date : Inscription en doctorat le 30/09/2022
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cancérologie, Biologie, Médecine, Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Cancer, Hétérogénéité, Instabilité et Plasticité
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Diversité et Plasticité des tumeurs de l'enfant (DePiCT)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Institut Curie (Paris ; 1978-....)

Mots clés

Mots clés libres

Thérapie

Cellules immunitaires

Cellules tumorales

Microenvironnement

Neuroblastome

Interactions récepteurs/ligands

Immune cells

Therapy

Neuroblastoma

Microenvironment

Ligand/receptor interactions

Tumor cells

Résumé

Le microenvironnement tumoral représente un élément clé de l'écosystème tumoral dont la complexité doit être comprise pour définir de nouvelles stratégies thérapeutiques, y compris des approches d'immunothérapie. Les avancées récentes dans le séquençage des ARNs au niveau de la cellule unique (scRNA-seq) permettent désormais de définir l'hétérogénéité des écosystèmes tumoraux, non seulement en termes de cellules tumorales mais aussi en termes de cellules immunitaires et stromales. Il a été démontré que les interactions hétérotypiques entre les cellules stromales, immunitaires et tumorales jouent un rôle important dans le maintien, la progression, les métastases et la réponse thérapeutique de la tumeur. Notre équipe a récemment généré des données transcriptomiques sur cellules uniques pour 10 neuroblastomes de 5 patients au diagnostic et 5 patients en rechute. Dans ces biopsies, nous avons obtenu le profil transcriptomique de plus de 20 000 cellules et identifié 6 types cellulaires principaux (cellules tumorales, cellules B et T, cellules myéloïdes, cellules endothéliales et fibroblastes). Nous avons également analysé 3 tumeurs de souris transgéniques TH-MYCN, qui représentent un modèle pertinent de neuroblastome dans un contexte immunocompétent. Nos résultats ont démontré que les tumeurs du neuroblastome des deux organismes ont un microenvironnement caractérisé par une immunosuppression incluant des lymphocytes T dysfonctionnels et une accumulation de cellules immunosuppressives (Costa et al, soumis). Ces travaux fournissent une base de données solide et originale pour mieux comprendre l'écosystème du neuroblastome et proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques, ciblant à la fois les cellules tumorales et certains composants du microenvironnement. La stratégie suivante sera appliquée pour comprendre les communications entre les cellules cancéreuses et les cellules du microenvironnement et proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Une analyse préliminaire à l'aide de l'outil CellPhoneDB (Efremova et al, 2020) qui infère les communications intercellulaires en mesurant l'expression des ligands et des récepteurs dans plusieurs types de cellules (à l'aide d'une base de données de 1396 interactions) a identifié 115 paires récepteur/ligand impliquées dans 444 interactions en considérant les six principales populations dans l'ensemble des données intégrées des 10 biopsies de patients. L'analyse des tumeurs individuelles sera nécessaire pour confirmer les interactions récepteur/ligand détectées dans l'ensemble des données intégrées. Des analyses plus fines seront également réalisées sur des populations définies plus précisément, en particulier pour les cellules myéloïdes pour lesquelles différents sous-populations ont désormais été caractérisées. L'expression des paires de récepteurs et de ligands sera également étudiée à l'aide d'outils plus récents et plus puissants tels que CellChat (Jin et al, 2021), CellCall (Yang Zhang et al, 2021) ou Connectome (Raredou et al, 2022). Certains de ces outils permettent de définir comment les ligands exprimés par une cellule émettrice peuvent induire des changements d'expression génique dans la cellule réceptrice, en identifiant les facteurs de transcription et les gènes cibles impliqués. Plusieurs classes d'interactions seront prises en compte dont les interactions définies entre différents types de cellules immunitaires ou stromales et les interactions définies entre des cellules immunitaires ou stromales et des cellules tumorales. La même approche sera appliquée sur les données obtenues pour le modèle de neuroblastome murin TH-MYCN et les résultats seront comparés entre les tumeurs des deux espèces. En parallèle, nous explorerons le microenvironnement tumoral d'une série de 15 modèles de neuroblastomes PDX pour lesquels des données transcriptomiques en cellules uniques sont disponibles au laboratoire. Ces modèles sont intéressants car ils présentent plus de diversité en termes d'altérations génétiques par rapport au modèle TH-MYCN, même s'ils sont obtenus chez des souris Nude déficientes en lymphocytes T. Dans ces modèles, les interactions seront explorées entre les cellules tumorales humaines et les cellules murines du microenvironnement. Selon les données de la littérature et la conservation potentielle entre les tumeurs humaines et les tumeurs de souris, les paires les plus pertinentes seront sélectionnées pour validation. Des expériences par immunohistochimies seront réalisées pour confirmer l'expression des molécules d'intérêt sur des échantillons FFPE de tumeurs murines ou humaines. Nous accorderons une attention particulière aux candidats qui pourraient être ciblés par des inhibiteurs permettant de neutraliser les cellules immunosuppressives ou perturber les interactions contribuant à l'environnement immunosuppresseur. Des tests fonctionnels seront effectués in vitro à l'aide de systèmes de co-culture, soit dans des conditions classiques 2D, soit dans des conditions 3D, en utilisant une approche Tumor-on-Chip (ToC), en collaboration avec Maria-Carla Parrini dans notre unité. Cette technologie, qui utilise des « puces » contenant des matrices d'hydrogels biomimétiques 3D associées à de la microfluidique, permet de reconstituer partiellement ex vivo la complexité du microenvironnement tumoral et la dynamique cellulaire impliquant plusieurs types de cellules (Nguyen et al, 2018 ; Parrini MC, 2020). Nous prévoyons de co-cultiver des cellules tumorales, des cellules myéloïdes et des lymphocytes T obtenus de nos modèles murins dans ces ToC et d'explorer l'effet de divers inhibiteurs ciblant des interactions spécifiques. Dans cette approche, le suivi de la mort des cellules tumorales est réalisé grâce à des traceurs spécifiques et à leur suivi par vidéomicroscopie. Le rôle d'interactions spécifiques récepteur/ligand pourra également être exploré en utilisant des stratégies de knockdown par si/shRNA des molécules d'intérêt dans les cellules de neuroblastome. Enfin, des expériences in vivo seront mises en place pour déterminer le rôle de certaines interactions et l'efficacité de différents inhibiteurs dans des modèles pré-cliniques relevants, souris TH-MYCN et PDXs. Par ailleurs, nous prévoyons d'utiliser l'anticorps monoclonal anti-GD2 qui induit un mécanisme appelé ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) impliquant les cellules NK pour cibler les cellules tumorales. Le GD2 est une molécule lipidique glycosylée appartenant à la classe des glycosphingolipides qui est fortement exprimée à la surface cellulaire des cellules tumorales du neuroblastome. Il a été montré que le dinutuximab, un Ab monoclonal chimérique ciblant le GD2 améliore la survie des enfants atteints de neuroblastome à haut risque, qui ont répondu au traitement d'induction et de consolidation, lorsqu'il est combiné au GM-CSF et à l'IL2 (Yu et al, 2010). Nous avons déjà identifié un rationnel pour deux combinaisons qui devraient augmenter l'activité anti-tumorale NK induite par l'anticorps anti-GD2 et augmenter la prolifération et l'activité des lymphocytes T. Ces combinaisons impliqueront soit des petites molécules, soit des anticorps neutralisants en plus de l'anticorps anti-GD2. L'impact de l'anticorps anti-GD2 et/ou des combinaisons sur le microenvironnement tumoral sera évalué avec des modèles murins utilisant des expériences FACS et/ou RNA-seq sur cellule unique pour déterminer comment le traitement modifie le phénotype des cellules myéloïdes et T. Globalement, ce projet vise à comprendre les communications entre les cellules cancéreuses et les cellules du microenvironnement et comment divers signaux affectent les propriétés et l'identité des cellules réceptrices. Des analyses complémentaires basées sur la transcriptomique spatiale permettront de disséquer l'organisation complexe de la tumeur et de son microenvironnement. Ces analyses nous aideront à définir de nouvelles thérapies qui pourraient neutraliser le microenvironnement tumoral immunosuppresseur chez les patients atteints de neuroblastome.

Tumor microenvironment represents a key component of the tumor ecosystem the complexity of which has to be accurately understood to define selective targeting opportunities, including immune-base therapies. Recent advances in single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) now allow to define the heterogeneity of tumor ecosystems, not only in terms of tumor cells but also in terms of immune and stromal cells. Heterotypic interactions between stromal, immune and tumor cells have been shown to play important roles in tumor maintenance, progression, metastasis and therapeutic response. Our team has recently generated single-cell transcriptomic data for 10 human neuroblastomas, from 5 patients at diagnosis and 5 patients at relapse. In human biopsies, we profiled more than 20,000 cells and identified 6 main cell types (Tumor cells, B and T cells, myeloid cells, endothelial cells and fibroblasts). We also analyzed 3 tumors of transgenic TH-MYCN mice, that represent a relevant neuroblastoma model in an immunocompetent background. Our results demonstrated that neuroblastoma tumors of both organisms have an immunocompromised microenvironment characterized by dysfunctional T-cells and accumulation of immunosuppressive cells (Costa et al, submitted). This work provides a new and precious data resource to better understand the neuroblastoma ecosystem and suggest novel therapeutic strategies, targeting both tumor cells and components of the microenvironment. The following strategy will be applied to understand the cross-talks between cancer cells and cells of the microenvironment and propose novel therapeutic strategies. Preliminary analysis using the CellPhoneDB tool (Efremova et al, 2020) that infers intercellular communications by measuring the expression of ligands and receptors in multiple cell types (using a database of 1396 interactions) identified 115 receptor/ligand pairs involved in 444 interactions considering the six main populations in the integrated dataset of 10 human biopsies. Analysis of tumors individually will be required to confirm the receptor/ligand interactions detected in the integrated dataset. Further analyses will be also performed using more precisely defined populations, in particular for myeloid cells for which various subsets have now been highlighted. Expression of receptor and ligand pairs will be also investigated using more recent and powerful tools such as CellChat (Jin et al, 2021), CellCall (Yang Zhang et al, 2021) or Connectome (Raredou et al, 2022). Some of these tools may allow also to assess how ligands expressed by a sender cell can predict changes in gene expression in the receiver cell, by defining the involved transcription factors and target genes. Several classes of interactions will be considered including interactions defined between various types of immune or stromal cells and interactions defined between specific immune or stromal cells cells and tumor cells. The same approach will be performed on data obtained for the murine TH-MYCN neuroblastoma model and results will be compared between the tumors of both species. In parallel, we will explore the tumor microenvironment in a series of 15 PDX neuroblastoma models for which single-cell transcriptomics data are available in the lab. These models are of interest since they present more diversity in terms of genetic alterations compared to the TH-MYCN model, even if they are grown in Nude mice that are deficient in T cells. In these models, interactions will be explored between human tumor cells and murine cells of the microenvironment. According to biological knowledge, and potential conservation between the human tumors and mouse tumors, the most relevant pairs will be prioritized for further validation. We will pay special attention to druggable candidates that could be targeted to achieve depletion of immunosuppressive cells or disrupt interactions contributing to the immunosuppressive environment. Functional assays will be performed in vitro using co-culture systems, either in classical 2D conditions and in 3D, using a Tumor-on-Chip (ToC) approach, in collaboration with Maria-Carla Parrini in our unit. This technology, that uses chips with 3D biomimetic hydrogel matrices in microfluidics, allows to partially reconstitute ex vivo the complexity of the tumor microenvironment and the cellular dynamics involving multiple cell types (Nguyen et al, 2018; Parrini MC, 2020). We plan to co-culture tumor cells, myeloid cells and T lymphocytes obtained from murine models in ToC and explore the effect of various inhibitors targeting specific interactions. In this approach, the monitoring of tumor cell death is carried out using specific tracers and their monitoring by videomicroscopy. The role of specific receptor/ligand interactions will be further explored using si/shRNA gene knockdown of the molecules of interest in the neuroblastoma cells. Immunohistochemistry will be done to confirm the expression of the molecules of interest on FFPE samples of murine or human tumors. Finally, in vivo experiments will be setup to confirm the role of specific interactions and efficacy of various inhibitors in relevant pre-clinical models. In addition, we plan to use the anti-GD2 monoclonal antibody that induces antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) involving NK cells to target tumor cells. GD2 is a glycosylated lipid molecule that belong to the glycosphingolipid class that is highly expressed on the cell surface of neuroblastoma tumor cells. Dinutuximab, a chimeric anti-GD2 mAb, has been shown to improve the survival for children with high-risk neuroblastoma that had responded to induction and consolidation therapy, when combined to GM-CSF and IL2 (Yu et al, 2010). We have already identified a rationale for two combinations that should increase the NK anti-tumor activity induced by the anti-GD2 antibody and increase the proliferation and activity of T cells to kill tumor cells. These combinations will involve either small-molecules or neutralizing antibodies in addition to the anti-GD2 antibody. The impact of the anti-GD2 antibody and/or of combinations on the tumor microenvironment will be assessed with murine models using FACS and/or single-cell RNA-seq experiments to determine how the treatment changes the phenotype of myeloid and T cells. Overall, this project aims at understanding the cross-talks between cancer cells and cells of the microenvironment and how various signals affect the properties and identity of the receiver cells. Additional analyses based on spatial transcriptomics will allow to dissect the intricate organization of the tumor and its microenvironment. These analyses will help us to define novel therapies that could reverse the immunosuppressive tumor microenvironment in neuroblastoma patients.