Développement et caractérisation fonctionnelle de protéines artificielles (αReps) ciblant le pic des coronavirus porcins

Development and Functional Characterization of Artificial Proteins (αReps) Targeting the Spike of Porcine Coronaviruses

• Auteur / Autrice : Mantasha Khan
• Direction : Bernard Delmas
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Inscription en doctorat le 01/11/2022
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et dynamique des systèmes vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : VIM - Virologie et Immunologie Moléculaires
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université de Versailles-Saint-Quentin-en-Yvelines

Mots clés

Mots clés libres

Coronavirus

Antiviraux

Porcins

Spike

Coronavirus

Antivirals

Porcine

Spike

Résumé

Titre : Développement et caractérisation fonctionnelle de protéines artificielles (αReps) ciblant le pic des coronavirus porcins Les coronavirus porcins présentent des risques importants pour la santé des porcs et pour l'économie agricole. Parmi ceux-ci, deux virus majeurs sont particulièrement préoccupants : le virus de la gastro-entérite transmissible (TGEV) et le virus de la diarrhée épidémique porcine (PEDV). Le PEDV entraîne de graves diarrhées et des taux de mortalité élevés chez les porcelets, entraînant des pertes économiques substantielles dues à une baisse de productivité. Le VGET, virus très contagieux, induit une gastro-entérite mortelle chez le porcelet et présente un double tropisme, infectant à la fois l'épithélium digestif et respiratoire. Nous avons utilisé une bibliothèque de phage display de séquences de protéines biosynthétiques construites sur un cadre rigide de type HEAT en hélice alpha (appelé α-Reps) pour découvrir des candidats potentiels qui reconnaissent et s'attachent aux protéines de pointe du PEDV et du TGEV, comme nous l'avons fait avec succès. contre le SRAS-CoV-21. Le dépistage par phage display a ciblé trois régions spécifiques : le domaine de liaison au récepteur (RBD) du PEDV, du S1-PEDV et du S1-TGEV. Les αReps sélectionnés ont été synthétisés dans des systèmes bactériens et ensuite analysés pour leurs propriétés biologiques, y compris leur affinité de liaison avec la protéine de pointe et leurs caractéristiques fonctionnelles. Les criblages ont donné de nombreux liants αRep présentant des affinités notables. Un liant, désigné D12, a démontré une formation de complexe stable entre D12 αReps et S1-PEDV. Des expériences de neutralisation ont été menées pour évaluer leur efficacité dans la prévention des infections virales in cellulo. Les résultats préliminaires suggèrent une forte affinité de liaison pour certains liants αRep. Ces résultats soulignent la nécessité d'une validation et d'une optimisation supplémentaires pour évaluer définitivement le potentiel neutralisant des αReps. À l'avenir, l'objectif est de trimériser le liant αRep le plus puissant découvert tout au long du processus de criblage du S1-PEDV, en supposant que la trimérisation pourrait potentiellement augmenter sa capacité à se lier et à favoriser la neutralisation du PEDV. Dans le cadre de notre stratégie globale, nous examinerons la capacité des αReps à se neutraliser dans un système plus adapté aux conditions physiologiques, utilisant spécifiquement des organoïdes intestinaux. Notre objectif est d'évaluer l'efficacité de la neutralisation en infectant ces organoïdes avec le PEDV puis en les traitant avec les αReps identifiés. La forte stabilité et l'efficacité des αReps contre les coronavirus porcins suggèrent leur potentiel en tant qu'agents thérapeutiques pour gérer les infections et limiter la transmission du virus dans les populations porcines. Notre méthodologie, basée sur les réalisations antérieures dans le traitement des coronavirus apparentés, souligne son applicabilité aux recherches antivirales en cours et sa capacité à améliorer considérablement la santé des porcs.

Title: Development and Functional Characterization of Artificial Proteins (αReps) Targeting the Spike of Porcine Coronaviruses Porcine coronaviruses present significant risks to the health of swine and the agricultural economy. Among these, two major viruses are of particular concern: Transmissible Gastroenteritis Virus (TGEV) and Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV). PEDV leads to severe diarrhea and high mortality rates in piglets, causing substantial economic losses due to decreased productivity. TGEV, a highly contagious virus, induces lethal gastroenteritis in piglets and exhibits dual tropism, infecting both the digestive and respiratory epithelium. We used a phage-display library of biosynthetic protein sequences constructed on a rigid alpha-helical HEAT-like framework (referred to as α-Reps) to discover potential candidates that recognize and attach to the spike proteins of PEDV and TGEV as we successfully did against SARS-CoV-21. The phage display screening targeted three specific regions: the receptor binding domain (RBD) of PEDV, S1-PEDV, and S1-TGEV. The selected αReps were synthesized in bacterial systems and subsequently analyzed for their biological properties, including their binding affinity with spike protein and functional characteristics. The screenings yielded many αRep binders with notable affinities. One binder, designated D12, demonstrated stable complex formation between D12 αReps and S1-PEDV. Neutralization experiments were conducted to assess their efficacy in preventing viral infection in cellulo. Preliminary results suggested strong binding affinity for certain αRep binders. These findings underscore the necessity for additional validation and optimization to definitively evaluate the neutralizing potential of αReps. Moving forward, the aim is to trimerize the most powerful αRep binder that was discovered throughout the S1-PEDV screening process hypothesizing trimerization could potentially increase its ability to bind and promote the neutralization of PEDV. As part of our comprehensive strategy, we will examine the ability of αReps to neutralize in a system that is more relevant to physiological conditions, specifically employing intestine organoids. Our aim is to evaluate the effectiveness of neutralization by infecting these organoids with PEDV and then treating them with the identified αReps. The strong stability and effectiveness of αReps against porcine coronaviruses suggest their potential as therapeutic agents for managing infections and restricting virus transmission in swine populations. Our methodology, based on previous achievements in dealing with related coronaviruses, emphasizes its applicability to ongoing antiviral investigations and its capacity to significantly improve swine health.