Plateforme électroanalytique multiparamétrique intégrée pour le monitoring d'organoïdes

Integrated multiparametric electroanalytical platform for organoid monitoring

• Auteur / Autrice : Marie-helene Steger-polt
• Direction : Pascal Mailley
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : 2MGE - Matériaux, Mécanique, Génie civil, Electrochimie
• Date : Inscription en doctorat le 27/09/2022
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Ingénierie - matériaux mécanique énergétique environnement procédés production (Grenoble ; 2008-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : CEA Grenoble - LETI

Mots clés

Mots clés libres

Organoïdes

Monitoring

Électroanalytique

Organoid

Monitoring

Electroanalytical

Résumé

Les dispositifs d'organoïde sur puce (OSP) suscitent depuis une décennie de nombreux travaux scientifiques. En effet, l'introduction dans des composants microfluidiques de structures tissulaires, mimant par leur fonction et leur architecture le comportement d'organes, permet des études approfondies de leur fonctionnement et ou de leur comportement lorsqu'ils sont soumis à des agressions, des stress physiques, physicochimiques ou moléculaires. Par exemple, ces dispositifs pourraient permettre à terme d'étudier l'impact d'un médicament ou d'un biomatériau sur la viabilité des cellules constitutives de l'organe cible sans avoir ou en limitant le recours à des expérimentations animales. Par ailleurs, ces dispositifs ouvrent la voie à la mise en œuvre d'une médecine personnalisée utilisant les cellules propres du patient traité. Toutefois, leur applicabilité présente plusieurs limites liées à la nature de leur observation temporelle basée essentiellement sur des analyses microscopiques et des mesures (bio)chimiques séquentielles voir ponctuelles . La pleine et entière utilisation de ces dispositifs passe donc par l'implémentation de mesures en temps réel permettant de comprendre, d'analyser la réponse des organoïdes à une sollicitation via le monitoring de son fonctionnement cellulaire. Pour cela, il est donc important d'intégrer dans capteurs capables de mesurer in situ ce fonctionnement via la détection, la quantification de métabolites et ou de sécrétions biomoléculaires utilisés comme biomarqueurs des fonctions cellulaires. De façon complémentaire, le maintien dans le temps de l'organoïde pour sa maturation (différentiation cellulaire, autoorganisation, croissance...) puis son utilisation est un aspect clé du développement des OSP. Le contrôle, voir asservir, du milieu de culture, d'une part, et la qualification de la viabilité des édifices biologiques d'autre part sont deux autres objectifs qui peuvent être assumer par des mesures in situ via des (bio)capteurs. L'intégration de capteurs de monitoring en temps réel est donc un objectif crucial pour à terme fiabiliser et déployer les OSP comme nouveaux outils de recherche pour le médical ou le développement de thérapies innovantes. Parmi les nombreuses méthodologies de mesures existantes, l'électrochimie présente de nombreux avantages (miniaturisation, sensibilité, coût, sélectivité) pour la caractérisation in situ de tissus biologiques soumis à des agressions externes soit moléculaires soit biologiques. En effet, selon la méthodologie électrochimique utilisée il est possible de mesurer soit l'évolution de paramètres physiologiques et/ou de culture (pH, oxygène...), soit la consommation ou la sécrétion de métabolites, impliqués dans le comportement cellulaire (glucose, lactate, NO, H2O2, ATP, K+...) ou encore l'intégrité des tissus biologiques (spectroscopie d'impédance, TEER...). Cette diversité des mesures permet ainsi de retracer le comportement du réseau cellulaire en cours de croissance ou soumis à une sollicitation biologique physique ou physicochimique. Néanmoins, à l'heure actuelle, exceptées les mesures de TEER (TransEpithelial Electrical Resistance), la plupart de ces mesures sont effectuées ex situ. L'objectif principal de cette thèse est de développer un dispositif d'OSP destiné au monitoring de couches barrières ou de tissus épithéliaux intégrant une plateforme multiparamétrique de capteurs électrochimiques permettant conjointement des mesures in et ex situ de différentes natures. Le travail de thèse fait suite à différents travaux menés au sein des laboratoires partenaires du DTBS. Au cours de ces travaux, différents modules de mesure ont été développés qui n'ont jamais été co-intégrés mais qui présente un intérêt fort pour le monitoring de tissus cellulaires. Le projet de thèse se déroulera en 3 phases distinctes, la miniaturisation / adaptation des modules existant, l'intégration fluidique du dispositif et l'application à la caractérisation de couches épithéliales. 1. La première phase se concentrera sur chacun des modules présentés figure 1. Cette phase se concentrera sur la conception microfluidique du dispositif et sur sa connectivité fluidique et électrique afin de procéder à terme à l'intégration du système sur une carte fluidique maîtresse. a. Pour ce qui est du module d'impédance, il sera modifié afin d'intercaler une membrane poreuse qui pourra servir de support à la structure épithéliale. Cette membrane sera déformable ce qui permettra par un différentiel de pression entre les compartiments haut et bas d'appliquer un stress mécanique ou une sollicitation mécanique modulée sur le tissu biologique supporté. Cette modification du design impliquera aussi une connectivité fluidique sur chacun des compartiments qui n'existe pas actuellement. Enfin au-delà du capteur d'impédance (2 électrodes réparties en bas et en haut du compartiment, des microélectrodes indicatrices seront intégrées (typiquement pour la mesure du pH par potentiométrie, de l'oxygène, du NO et/ou de H2O2 par ampérométrie). La connectique sera alors adaptée afin de faire une mesure multiparamétrique à partir de cette plateforme. b. La plateforme multiparamétrique externe devra être miniaturisée afin de fournir des mesures cohérentes avec les flux de nutriments traversant le dispositif. Ceci implique une diminution de la taille de la chambre fluidique mais aussi une miniaturisation des capteurs qui seront destinés à la mesure de métabolites tels que le lactate ou encore le glucose. Cette miniaturisation sera supportée par une modélisation de la chambre de mesure afin de mieux comprendre l'influence du design sur la mesure (diffusion restreinte, convection...) 2. La deuxième phase du projet concernera l'intégration fluidique des différents modules sur un carte fluidique maitresse tel que représenté dans la figure 1. Cette intégration permettra de travailler sur la mise en œuvre des fluides nécessaires pour la maturation et la survie du tissu épithélial étudié. Cette phase permettra par ailleurs d'adapter les mesures aux conditions de culture (nature des fluides, convection...) afin de mieux appréhender de possibles effets d'interférence liés à leur composition 3. La troisième phase du projet sera dédiée à la mise en œuvre du dispositif ainsi fabriqué sur la maturation d'un organoïde épithéliale. Dans un premier temps afin de vérifier les potentialités du système, les mesures seront faites sur une simple culture de cellules épithéliales qui seront soumises à un stress chimique en fin de croissance. Les différentes électrodes permettront la caractérisation de la culture cellulaire et de son inactivation. La suite se concentrera sur la mise en œuvre d'un organoïde de couche barrière ou de tissus épithéliale complexe afin de démontrer les potentialités de notre approche en terme de monitoring des OSP. Ce sujet transverse et pluridisciplinaire fait intervenir les compétences du L2CB en électrochimie mais également celles du LSMB en intégration fluidique et en μfabrication. Ces 2 laboratoires du DTBS ont l'habitude de travailler ensemble sur des projets d'intégration de capteurs dans des systèmes microfluidiques. Ce travail sera développé conjointement avec une équipe spécialiste des couches barrières ou des tissus épithéliaux.

Organoid-on-a-chip (OSP) devices have been the subject of much scientific work over the past decade. Indeed, the introduction in microfluidic components of tissue structures, mimicking by their function and architecture the behavior of organs, allows in-depth studies of their functioning and or their behavior when they are subjected to aggressions, physical, physicochemical or molecular stresses. For example, these devices could eventually make it possible to study the impact of a drug or a biomaterial on biomaterial on the viability of the constituent cells of the target organ without having or limiting the use of animal experiments. Moreover, these devices open the way to the implementation of personalized medicine using the treated patient's own cells. However, their applicability presents However, their applicability has several limitations related to the nature of their temporal observation based essentially on microscopic analyses and sequential or even punctual (bio)chemical measurements. The full and complete use of these devices of these devices requires the implementation of real time measurements to understand and analyze the response of the organoids, analyze the response of organoids to a solicitation via the monitoring of its cellular functioning. For this, it is therefore important to integrate sensors capable of measuring in situ this functioning via the detection, quantification of metabolites and or biomolecular secretions used as biomarkers of cellular functions. In a complementary way, the maintenance in time of the organoid for its maturation (cell differentiation, self-organization, growth...) and then its use is a key aspect of the development of OSP. The control, or even slaving, of the culture medium, on the one hand, and the qualification of the viability of the biological edifices are two other objectives that can be assumed by in situ in situ measurements via (bio)sensors. The integration of real time monitoring sensors is therefore a crucial objective to crucial objective to eventually make PSO's reliable and deploy them as new research tools for the medical medical research or the development of innovative therapies. Among the many existing measurement methodologies, electrochemistry has many advantages (miniaturization, sensitivity, and advantages (miniaturization, sensitivity, cost, selectivity) for the in situ characterization of biological tissues subjected to external aggressions, either molecular or biological. Indeed, according to the methodology used, it is possible to measure either the evolution of physiological and/or culture parameters parameters (pH, oxygen...), or the consumption or secretion of metabolites, involved in the behavior (glucose, lactate, NO, H2O2, ATP, K+...) or the integrity of biological tissues (impedance spectroscopy, TEER...). This diversity of measurements allows us to trace the behavior of of the cellular network during growth or under physical or physicochemical biological stress. physical or physicochemical stress. Nevertheless, at the present time, except for TEER (TransEpithelial Electrical Resistance), most of these measurements are performed ex situ. The main objective of this thesis is to develop a PSO device for the monitoring of barrier layers or epithelial barrier layers or epithelial tissues integrating a multiparametric platform of electrochemical sensors allowing jointly in and ex situ measurements of different natures. The thesis work follows different works carried out within the partner laboratories of the DTBS. During this work, different measurement modules have been developed which have never been co-integrated but which are of great interest for the monitoring of cellular tissues. The thesis project will take place in 3 distinct phases, the miniaturization / adaptation of the existing modules, the fluidic integration of the device and the application to the characterization of epithelial layers.