Suivi du devenir des vésicules extracellulaires sécrétées en contexte cellulaire et in vivo.

Tracking the fate of secreted extracellular vesicles in cellular and in vivo context

• Auteur / Autrice : Louise Merle
• Direction : Alain Joliot
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Inscription en doctorat le 03/10/2022
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Immunité et cancer (Paris ; 2009)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Institut Curie (Paris ; 1978-....)

Mots clés

Mots clés libres

Vésicules extracellulaires

Exosomes

Communication intercellulaire

Biotinylation de proximté

Cancer

Système immunitaire

Extracellular vesicles

Exosomes

Intercellular communication

Proximity biotinylation

Cancer

Immune system

Résumé

Les vésicules sécrétées entourées d'une membrane, collectivement appelées vésicules extracellulaires (VE), sont des véhicules de communication essentiels entre les cellules, en raison de leur contenu riche en lipides, protéines et acides nucléiques. Pour déchiffrer la fonction des VE, il faut caractériser leur destin une fois sécrétées dans l'espace extracellulaire, en particulier dans des contextes in vivo, y compris leur dissémination ; leur capacité à interagir avec et à délivrer leur contenu dans des cellules cibles. Ces dernières années, des stratégies de biotinylation de proximité spécifiques aux tissus ont permis de suivre in vivo le devenir des protéines sécrétées qui transitent par la voie classique du RE au Golgi. Le premier objectif du projet est d'adapter cette stratégie aux voies de sécrétion des VE en sélectionnant des appâts appropriés (la protéine fusionnée à la biotine ligase), connus pour se localiser dans les VE ou le long des voies de biogenèse des VE. La sélectivité de chaque appât pour le marquage des VE sera évaluée en analysant les fractions enrichies en VE et dans les protéines solubles du milieu conditionné, séparées par chromatographie d'exclusion de taille. La livraison du contenu des VE dans le cytosol de la cellule cible sera évaluée par le test de la nanoluciférase fractionnée, par la capacité d'une nanoluciférase piégée dans les VE à reconstituer l'activité luciférase dans des cellules exprimant dans leur cytosol le fragment complémentaire de luciférase. Ces deux stratégies seront d'abord mises en œuvre en culture cellulaire en utilisant les cellules cancéreuses de souris E0771 pour sélectionner les appâts appropriés et les marqueurs intraluminaux des VE. Elles seront ensuite adaptées au contexte in vivo, lors de l'implantation des cellules E0771 dans des modèles de souris immunocompétentes.

Secreted membrane-enclosed vesicles collectively called extracellular vesicles (EVs) are essential communication vehicle between cells, owing to rich content in lipids, proteins, and nucleic acids. Deciphering EV function needs to characterize their fate once secreted in the extracellular space, especially in in vivo contexts, including their dissemination their ability to interact with and deliver their content into target cells. In the recent years, tissue-specific proximity biotinylation strategies have been successful to follow in vivo the fate of secreted proteins that transit through the conventional ER to Golgi pathway. The first goal of the project is to adapt this strategy to EV secretion pathways by selecting appropriates baits (the protein fused to the biotin ligase), known to localize either in EVs or along EV biogenesis pathways. The selectivity of each bait toward EV labelling will be evaluated by analyzing the EV-enriched and protein soluble fractions of the conditioned media separated by size exclusion chromatography. Delivery of EV content into the cytosol of the target cell will be assessed using the split Nanoluciferase assay, by the ability of a nanoluciferase entrapped in EVs to reconstitute luciferase activity in cells expressing in their cytosol the complementary luciferase fragment. These two strategies will be first implemented in cell culture using the mouse cancer cells E0771 to select the appropriate baits and intraluminal EV markers. Then, they will be adapted to in vivo context, upon implantation of E0771 cells in immunocompetent mouse models.