Régulation des Gènes d'Inflammation en Sénescence

Regulation of Inflammatory Gene Expression in Senescence

• Auteur / Autrice : Reem Hamed
• Direction : Carl Mann
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2022
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et dynamique des systèmes vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : I2BC - Institut de Biologie Intégrative de la Cellule
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Faculté des sciences d'Orsay

Mots clés

Mots clés libres

Sénescence

Régulation des Gènes

Inflammation

Senescence

Inflammatory Gene

Gene Expression

Résumé

La sénescence cellulaire représente une réponse aux stress des cellules de mammifères associée à un arrêt prolifératif et une modification du transcriptome, y compris une activation de l'expression des gènes d'inflammation. L'expression des facteurs inflammatoires dans les cellules sénescences a des effets bénéfiques, notamment lors de la cicatrisation en cas de blessure, et pour recruter des cellules immunitaires aux cellules sénescentes afin d'assurer leur élimination. Toutefois, on constate une accumulation des cellules sénescentes avec l'âge qui contribue au développement des maladies liées au vieillissement. En particulier, on pense que cette augmentation de la charge des cellules sénescentes est néfaste en contribuant à l'installation d'un état d'inflammation chronique qui perturbe la structure tissulaire et le système immunitaire. Il y a donc intérêt à comprendre la régulation de l'expression des gènes d'inflammation en sénescence afin de se donner les possibilités d'intervenir pour soulager l'inflammation chronique liée au vieillissement. La plupart des données concernant l'expression des gènes d'inflammation en sénescence proviennent des études sur un petit nombre de lignées établies de fibroblastes humains (WI-38, IMR-90, BJ, HCA) dérivées de poumons embryonnaires ou du prépuce. Tous ces fibroblastes expriment fortement des gènes d'inflammation en sénescence induite par dommages à l'ADN. La régulation de l'expression des gènes d‘inflammation en sénescence implique plusieurs voies de signalisation (ATM, p38, cGAS/STING) et facteurs de transcription (RELA, CEBPB, AP-1), mais les données restent parcellaires. En particulier, nous avons récemment publié en collaboration avec l'équipe de Christian Muchardt, une étude montrant une diversité dans les voies d'activation de l'inflammation en sénescence en fonction du type cellulaire et l'inducteur de la sénescence (Life Science Alliance, 2021). De plus, lors d'une étude transcriptomique des fibroblastes primaires mammaires induits en sénescence par irradiation, nous avons observé une activation très restreinte des gènes d'inflammation par rapport aux fibroblastes WI-38 utilisés comme contrôle positif. Cette observation suggère qu'une expression forte des gènes d'inflammation n'est pas une caractéristique universelle des fibroblastes induites en sénescence par dommages à l'ADN. Le but de notre sujet de thèse est de déterminer par analyse transcriptomique si l'expression des gènes d'inflammation est rare ou fréquente dans des fibroblastes humains primaires en sénescence, et de comparer les transcriptomes des fibroblastes aptes ou inaptes d'exprimer ces gènes afin d'identifier des nouveaux régulateurs potentiels de leur expression. Nous avons obtenu une vingtaine de fibroblastes primaires provenant de sites anatomiques distincts (abdomen, poumons, sein, cuir chevelu, gencives, palais), de donneurs mâles et femelles d'âges différents en bonne santé ou après décès accidentellement, avec le consentement des individus. Nous avons induit la sénescence des fibroblastes par irradiation ionisante et nous avons collecté des ARNs pour faire du RNA-seq. L'analyse transcriptomique des échantillons nous permettra de classifier les fibroblastes par leur capacité d'exprimer des gènes d'inflammation en sénescence. Nous allons ensuite comparer l'état chromatinien et les transcriptomes des fibroblastes aptes ou inaptes d'exprimer des gènes d'inflammation. Au niveau transcriptomique, nous chercherons des gènes corrélées ou anti-corrélés avec l'expression des gènes d'inflammation qui pourraient représenter des activateurs ou des répresseurs de l'expression des gènes d'inflammation. Au niveau chromatinien, nous mettrons en évidence les sites de chromatine ouverte par ATAC-seq, et nous localiserons des enhanceurs par ChIP-seq H3-K27me3/H3-K4me1. L'analyse différentielle des ces régions génomiques pourraient identifier des sites de régulation qui déterminent la capacité des fibroblastes d'exprimer fortement des gènes d'inflammation en sénescence. Enfin, nous utiliserons les technologies de knock-down (sh-RNAs) ou knock-out (Crispr/Cas9) afin de tester l'importance des gènes/sites génomiques dans l'expression des gènes d'inflammation en sénescence. Ce projet nous permettra de mieux classifier les fibroblastes sénescents, et il nous permettra d'identifier des régulateurs qui déterminent l'aptitude des fibroblastes d'exprimer fortement des gènes d'inflammation en sénescence.

Cellular senescence is a stress response of mammalian cells associated with a proliferative arrest and a modification of the transcriptome, including the activation of inflammatory gene expression. The expression of inflammatory factors by senescent cells has beneficial effects in the context of wound healing, and in recruiting immune cells to the senescent cells to ensure their elimination. However, an accumulation of senescent cells is observed during aging that contributes to age-related diseases. In particular, the increase of senescent cells is thought to contribute to a chronic inflammation during aging (inflammaging) that perturbs the immune system and tissue structures. There is thus great interest in better understanding the regulation of inflammatory gene expression during aging in order to conceive treatments that reduce the chronic inflammation associated with aging. Most data concerning inflammatory gene expression in senescence comes from studies of a small number of established human fibroblast cell lines (WI-38, IMR-90, BJ, HCA) derived from embryonic lungs or fetal foreskins. All of these fibroblasts express high levels of inflammatory genes in senescence induced by DNA damage. The regulation of inflammatory gene expression in senescence involves several signaling pathways (ATM, p38, cGAS/STING,others) and transcription factors (RELA, CEBPB, AP-1, others), but we are far from having an exhaustive understanding of these pathways. In particular, we recently published in collaboration with Christian Muchardt, a study showing that a diverse set of inflammatory pathways are activated in senescence depending on cell type and the inducing stress (Life Science Alliance, 2021). Furthermore, we have unpublished transcriptome data from primary mammary fibroblasts induced into senescence by irradiation, showing that these cells express low levels of inflammatory genes in senescence compared to control WI-38 fibroblasts. This observation indicates that high-level expression of inflammatory genes is not a universal characteristic of senescent fibroblasts. The goal of our thesis subject is to determine by RNA-seq analyses whether high-level expression of inflammatory gene expression is a frequent or rare phenotype of senescent human fibroblasts, and to compare the transcriptomes of fibroblasts that are capable or incapable of expressing inflammatory genes in order to identify the regulatory factors that determine these phenotypic differences. We've obtained 20 primary fibroblasts from different anatomical sites (abdomen, lungs, breasts, scalp, gums, palate) and from men and women of different ages in good health or soon after accidental death, with the consent of the individuals or their families and an ethics committee. We induced their senescence by ionizing irradiation and we've collected RNA samples for RNA-seq analyses. The transcriptomic analysis of these samples will allow us to classify them by their capacity to express inflammatory genes in senescence. We will then compare the chromatin states and transcriptomes of fibroblasts that express high or low levels of inflammatory genes in senescence. At the transcriptomic level, we will search for genes that are correlated or anti-correlated with inflammatory gene expression that would represent candidate activators or repressors of inflammatory gene expression. At the chromatin level, we will identify open chromatin regions by ATAC-seq and enhancers by mapping H3-K27Ac and H3-K4me1. Differential analysis of these regions will highlight genomic regions representing regulatory sites controlling inflammatory gene expression in senescence. Finally, we will use knock-down (shRNAs) and knock-out (Crispr/Cas9) technologies to test the importance of these genes/genomic sites in the expression of inflammatory genes. This thesis project will allow us to better classify senescent fibroblasts, and it will identify key regulators determining whether or not senescent fibroblasts express high levels of inflammatory factors in senescence.