CISCO : Etude des régions CIS régulatrices de l'expression du gène PTEN et leur implication dans la maladie de COwden

CISCO : Characterization of PTEN expression Cis-regulatory elements involved in Cowden disease

• Auteur / Autrice : Thibaut Matis
• Direction : Nicolas Sevenet
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Génétique
• Date : Inscription en doctorat le 01/11/2022
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : BoRdeaux Institute of onCology
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Biotherapies genetics and oncology

Mots clés

Mots clés libres

Maladie de Cowden

Hi-C

Tad

Pten

Tiled-C

Crispr

Pten

Hi-C

Cowden disease

Tad

Tiled-C

Crispr

Résumé

La maladie de Cowden est une affection héréditaire de transmission autosomique dominante liée aux mutations constitutionnelles du gène suppresseur de tumeurs PTEN. Celui-ci code une phosphatase régulant négativement la voie de signalisation PI3K - AKT mais possède également une fonction nucléaire dont la finalité n'est pas encore connue avec précision. PTEN est altéré dans de très nombreux types tumoraux mais des mutations ponctuelles en phase codante s'observent essentiellement dans l'adénocarcinome de l'endomètre et dans le glioblastome. Dans d'autres types tumoraux, le mécanisme d'inactivation n'est pas établi avec certitude mais la perte d'expression pourrait être en rapport avec des cassures chromatiniennes situées au voisinage du gène. Par ailleurs, des mutations constitutionnelles s'observent à l'état hétérozygote chez les patients présentant une maladie de Cowden mais également dans un spectre phénotypique important allant du syndrome macrocéphalie-autisme à certaines polyposes juvéniles. L'extension du spectre phénotypique s'est accompagnée en clinique médicale d'un élargissement des indications de l'analyse constitutionnelle du gène PTEN et la mise en évidence d'une mutation a acquis un poids diagnostique important en définissant désormais un « PTEN Hamartoma Tumor Syndrome » ou PHTS. Parallèlement, le nombre de patients présentant un phénotype suspect de PHTS sans mutation identifiée en phase codante ou juxta-codante n'a fait que croître. En cas de phénotype caractéristique de maladie de Cowden le nombre de patient.e sans mutation identifiée est évalué à environ 20%. L'existence de patient.es au phénotype évocateur de maladie de Cowden sans mutation du gène PTEN identifiable pose la question, soit d'une hétérogénéité génétique dans cette maladie impliquant d'autres gènes que PTEN soit d'une hétérogénéité allélique sous formes de mutations cryptiques de ce gène. L'identification récente de modifications structurelles du gène PTEN sous forme d'insertion de séquences Alu en région codante nous incite à poursuivre l'exploration de la seconde hypothèse par la recherche de mutation à distance pouvant retentir sur l'expression de ce gène [1][2]. Par ailleurs, l'expression du gène PTEN est ubiquitaire, sous la dépendance d'un promoteur encore mal défini au sein duquel des mutations ponctuelles ont été décrites comme responsables de quelques cas de maladie de Cowden [3]. En 25 ans, nous avons isolé une trentaine de patient.es dont la présentation clinique correspondait à une probabilité de 100% de détecter une mutation constitutionnelle de PTEN (score clinique de Tan). Ne l'ayant pas détecté malgré l'ensemble des techniques mises en œuvre (Reséquençage ciblé, reséquençage locus entier, séquençage d'exome), nous faisons l'hypothèse de mutations à distance du gène (dans les TAD) pouvant éteindre l'expression du gène concourant au phénotype évocateur de maladie de Cowden. L'objectif de ce projet de thèse est donc l'exploration des interactions chromatiniennes au locus PTEN. L'organisation de la chromatine en domaines topologiquement associés (TAD pour Topologically Associated Domains) suggère la possibilité pour PTEN comme pour de nombreux autres gènes d'interactions chromatiniennes influant sur l'expression [4]. Les données d'ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements) suggèrent un site de fixation de facteurs de transcription à longue distance du gène PTEN en 3' (300 kb environ) situé au sein d'un désert génique constituant un TAD pouvant être associé à l'expression de PTEN. L'exploration de ces interactions repose sur les techniques de capture de conformation de la chromatine (3C pour Chromosome Conformation Capture et dérivées (HiC, 5C...) qui bénéficient désormais des approches de séquençage parallèle par NGS. Nous proposons de rechercher les séquences d'ADN en interaction avec le promoteur de PTEN, d'une part dans un modèle cellulaire exprimant fortement PTEN et d'autre part dans les lymphocytes de patients suspects de maladie de Cowden sans mutation PTEN identifiée. De même des lignées cellulaires tumorales mammaires démontrant une absence d'expression de PTEN dûe à une cassure chromosomique proche du locus seront utilisées pour mieux borner le TAD. Il s'agit d'une étude pilote rétrospective réalisée avec les prélèvements reçus au Centre de Lutte Contre le Cancer Institut Bergonié à Bordeaux. les critères d'inclusion des patients sont : 18 ans ou plus, maladie de Cowden cliniquement établie, absence de mutation délétère du gène PTEN identifiée en zone codante ou juxta-codant, ADN génomique disponible et formulaire de consentement pour l'examen des caractéristiques génétiques d'une personne et la conservation des échantillons dans une banque d'ADN ou un centre de ressources biologiques signé. Cette étude ancillaire entre dans le cadre de la constitution d'une cohorte de suivi prospectif de patient.es atteint.es de maladie de Cowden (projet COCO). références [1] Bubien et al (2017) Genes Chromosome Cancer 56, 788. [2] Crivelli et al (2017) EJHG 25, 1087. [3] Nizialek et al (2015) EJHG 23, 1538. [4] Bruneau & Nora (2018) Cell 175, 38.

Cowden's disease is an inherited, autosomal dominant disorder linked to constitutional mutations in the PTEN tumor suppressor gene. This encodes a phosphatase that negatively regulates the PI3K - AKT signaling pathway but also has a nuclear function, the purpose of which is not yet precisely known. PTEN is altered in a large number of tumor types, but point mutations in the coding phase are mainly seen in endometrial adenocarcinoma and in glioblastoma. In other tumor types, the mechanism of activation has not been established with certainty, but the loss of expression could be related to chromatin breaks located in the vicinity of the gene. In addition, constitutional mutations are observed in the heterozygous state in patients with Cowden's disease but also in a large phenotypic spectrum ranging from macrocephaly-autism syndrome to certain juvenile polyposes. The extension of the phenotypic spectrum has been accompanied in medical clinics by a widening of the indications for the constitutional analysis of the PTEN gene and the demonstration of a mutation has acquired significant diagnostic weight by now defining a 'PTEN Hamartoma Tumor Syndrome ”or PHTS. At the same time, the number of patients with a suspected PHTS phenotype without an identified mutation in the coding or juxta-coding phase has steadily increased. In the event of a characteristic Cowden disease phenotype, the number of patients without an identified mutation is estimated at around 20%. The existence of patients with a phenotype suggestive of Cowden's disease without an identifiable mutation of the PTEN gene raises the question, either of genetic heterogeneity in this disease involving genes other than PTEN or of allelic heterogeneity in the form of mutations. cryptics of this gene. The recent identification of structural modifications of the PTEN gene in the form of insertion of Alu sequences in the coding region prompts us to pursue the exploration of the second hypothesis by looking for distant mutations that could affect the expression of this gene [1 ] [2]. In addition, the expression of the PTEN gene is ubiquitous, dependent on a still poorly defined promoter in which point mutations have been described as responsible for a few cases of Cowden's disease [3]. In 25 years, we have isolated around thirty patients whose clinical presentation corresponded to a 100% probability of detecting a constitutional mutation of PTEN (Tan clinical score). Not having detected it despite all the techniques implemented (targeted resequencing, entire locus resequencing, exome sequencing), we hypothesize remote mutations of the gene (in TADs) that can extinguish expression. of the gene contributing to the phenotype suggestive of Cowden's disease. The objective of this thesis project is therefore the exploration of chromatin interactions at the PTEN locus. The organization of chromatin into Topologically Associated Domains (TAD) suggests the possibility for PTEN, as for many other genes, of chromatin interactions influencing expression [4]. ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements) data suggests a long-distance transcription factor binding site of the PTEN gene in 3 '(300 kb approximately) located within a gene desert constituting a TAD which may be associated with the expression of PTEN. The exploration of these interactions is based on chromatin conformation capture techniques (3C for Chromosome Conformation Capture and derivatives (HiC, 5C ...) which now benefit from parallel sequencing approaches by NGS. We propose to search for DNA sequences interacting with the PTEN promoter, on the one hand in a cell model strongly expressing PTEN and on the other hand in lymphocytes from patients suspected of Cowden disease without an identified PTEN mutation. Likewise, mammary tumor cell lines demonstrating an absence of PTEN expression due to a chromosomal break close to the locus will be used to better limit the TAD. This is a retrospective pilot study carried out with samples received at the Center de Lutte Contre le Cancer Institut Bergonié in Bordeaux. the patient inclusion criteria are: 18 years or older, clinically established Cowden's disease, absence of deleterious PTEN gene mutation identified in the coding or juxta-coding area, available genomic DNA and consent form for examination of genetic characteristics of a person and the storage of samples in a signed DNA bank or biological resource center. This ancillary study is part of the constitution of a prospective follow-up cohort of patients with Cowden's disease (COCO project). references [1] Bubien et al (2017) Genes Chromosome Cancer 56, 788. [2] Crivelli et al (2017) EJHG 25, 1087. [3] Nizialek et al (2015) EJHG 23, 1538. [4] Bruneau & Nora (2018) Cell 175, 38.