ÉTUDE DE LA PERFORATION DE LA PAROI CELLULAIRE BACTÉRIENNE PAR LE BACTÉRIOPHAGE T5

STUDY OF E. COLI CELL WALL PERFORATION BY BACTERIOPHAGE T5

• Auteur / Autrice : Alessio D'acapito
• Direction : Cécile Breyton
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Structurale et Nanobiologie
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2022
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Biologie Structurale
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Groupe membrane et pathogènes

Mots clés

Mots clés libres

Biologie Structurale

Bacteriophages

Cryo-tomographie électronique;

Perforation de la paroi bactérienne

Structural Biology

Bacteriophages

Cryo-electron tomography

Cell-wall perforation

Résumé

Contexte : Les bactériophages sont des nanomachines fascinantes infectant des hôtes bactériens très spécifiques. 60% des phages sont composés d'une capside, protégeant l'ADN viral, et d'une longue queue flexible, qui sert à reconnaître l'hôte, via une protéine de liaison au récepteur (RBP) située à l'extrémité de sa pointe. L'infection d'E. coli par le bactériophage T5 est initiée par la liaison irréversible de la RBP pb5 du T5, à son récepteur hôte E. coli, le transporteur de la membrane externe FhuA. Cette interaction déclenche l'ouverture de la capside, la perforation de la paroi cellulaire de l'hôte et la canalisation de l'ADN vers le cytoplasme de l'hôte. Lorsque cette interaction a lieu in vitro, lorsque FhuA est reconstitué en liposomes par exemple, tout l'ADN du phage est éjecté. Cependant, in vivo, l'éjection de l'ADN s'arrête après une éjection de 8% pour reprendre après l'inactivation des systèmes de défense bactériens par le phage. On soupçonne donc que les partenaires de l'hôte sont recrutés au niveau du canal. Le projet consiste à obtenir la structure du canal T5 par tomographie cryo-électronique in vivo, à comprendre comment le phage parvient à traverser la membrane externe puis la membrane interne, et à identifier et comprendre le rôle des facteurs de l'hôte. Nous disposons déjà d'un bel ensemble de données de tomogrammes de T5 interagissant avec les protéoliposomes FhuA, obtenus sur la plateforme de tomographie Instruct à Heidelberg. La structure résultant de la moyenne des subtomogrammes du canal T5 sera comparée à celle que le doctorant obtiendra sur la T5 interagissant sur des mini-cellules E. coli. Ces 'mini-cellules' proviennent d'une division anormale de E. coli, qui entraîne la formation de petites cellules rondes, dépourvues de nucléoïde, d'un diamètre compatible avec l'imagerie par microscopie électronique (ME). La membrane des mini-cellules contient, comme la cellule mère d'E. coli, de la FhuA. Au niveau du phage, nous avons déjà déterminé, à résolution atomique, la structure de l'extrémité de la queue de T5 avant et après interaction avec FhuA reconstitué en nanodisques : cette dernière structure sera précieuse pour s'insérer dans le subtomogramme des structures moyennées obtenues en tomographie cryo-électronique pour comprendre au niveau atomique la perforation de la paroi cellulaire du canal d'E. coli.

Background: Bacteriophages are fascinating nanomachines infecting very specifically bacterial hosts. 60% of them are composed of a capsid, protecting the viral DNA, and a long, flexible tail, which serves at recognising the host, via a Receptor Binding Protein (RBP) located at the tip of its spike. Infection of E. coli by bacteriophage T5 is initiated by the irreversible binding of T5 RBP pb5, to its E. coli host receptor, the outer membrane transporter FhuA. This interaction triggers the opening of the capsid, the perforation of the host cell wall and the channelling of the DNA to the host cytoplasm. When this interaction occurs in vitro, when FhuA is reconstituted into liposomes for example, all the phage DNA is ejected. In vivo however, DNA ejection halts after 8% ejection to resume after the bacterial defence systems inactivation by the phage. Host partners are thus suspected to be recruited at the channel level. The project is to obtain the structure of T5 channel by cryo-electron tomography in vivo, to understand how the phage manages to cross the outer- and then the inner-membrane, and to identify and to understand the role of host factors. We already have a beautiful data set of tomograms of T5 interacting with FhuA-proteoliposomes, obtained on the Instruct tomography platform in Heidelberg. The structure resulting from subtomogram averaging of T5 channel will be compared to the one the PhD student will obtain on T5 interacting on mini-E. coli cells. These “mini-cells” derive from E. coli abnormal division, which results in the formation of small round cells, devoid of nucleoid, of a diameter compatible with electron microscopy (EM) imaging. The membrane of the mini-cells will, as the mother E. coli cell, contain FhuA. At the level of the phage, we have already determined, at atomic resolution, the structure of T5 tail tip before and after interaction with FhuA reconstituted in nanodiscs: this latter structure will be precious to fit in the subtomogram averaged structures obtained in cryo- electron tomography to understand at atomic level the cell-wall perforation of E. coli channel.