Caractérisation des variants génétiques impliquant Pyk2 dans la maladie d'Alzheimer

Functional analysis of Alzheimer's disease-associated PTK2B gene variant

• Auteur / Autrice : Nina Lannette-Weimann
• Direction : Julie Dumont
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé - PHARM
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2022
• Etablissement(s) : Université de Lille (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Facteurs de risque et déterminants moléculaires des maladies liées au vieillissement

Mots clés

Mots clés libres

Alzheimer

Variants

Ptk2b

IPSC

Résumé

La maladie d'Alzheimer (MA) est la forme de démence la plus fréquente et la septième cause de décès dans le monde, affectant plus de 35 millions de personnes. Elle se caractérise par deux marqueurs pathologiques principaux : les plaques séniles, résultant de l'accumulation extracellulaire de peptides Aβ, et la dégénérescence neurofibrillaire, causée par l'agrégation intraneuronale de protéines Tau hyperphosphorylées. Ces anomalies entraînent une perte synaptique et la mort neuronale. Dans plus de 99 % des cas, la MA résulte d'une interaction entre des facteurs environnementaux et des facteurs de risque génétiques. Ces derniers jouent un rôle majeur, avec une héritabilité estimée entre 58 % et 79 % dans les études de jumeaux (Gatz et al., 2006). Les études d'association pangénomique (GWAS) ont identifié 76 loci associés au risque de MA, dont celui contenant le gène PTK2B (Bellenguez et al., 2022). PTK2B est fortement exprimé dans le cerveau humain, en particulier dans la microglie et les neurones glutamatergiques. Il code pour Pyk2, une tyrosine kinase cytosolique impliquée dans la voie des adhésions focales. Dans les neurones, Pyk2 joue un rôle dans la stabilisation des synapses via son interaction avec des protéines d'échafaudage telles que PSD-95 et dans la plasticité synaptique en influençant la phosphorylation des récepteurs NMDA. Dans le contexte de la MA, Pyk2 est impliqué dans la toxicité induite par les peptides amyloïdes et la phosphorylation de tau. Cependant, il reste incertain si une sous- ou sur-expression de cette protéine est délétère. Identifier les variants génétiques fonctionnels de PTK2B pourrait apporter des informations clés sur les mécanismes physiopathologiques dans lesquels Pyk2 est impliquée. Cette étude vise à caractériser l'impact fonctionnel de sept variants de PTK2B associées à un risque accru de MA, à l'aide d'approches in silico et in vitro. Ces variants, situés dans des régions cis-régulatrices, sont susceptibles d'affecter l'expression génique plutôt que la fonction/structure de la protéine. Les analyses bioinformatiques, combinées à des essais de gène rapporteur de luciférase et à des tests de retard sur gel (EMSA) réalisés à partir de cellules SH-SY5Y surexprimant ou non C/EBPβ, suggèrent que l'allèle à risque rs28834970 C favorise la fixation de C/EBPβ dans une région régulatrice de PTK2B, réduisant potentiellement son expression. Pour valider ces résultats et évaluer l'impact de ce variant sur l'expression de PTK2B et les phénotypes liés à la MA, nous avons généré des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) isogéniques différant uniquement par le génotype rs28834970 à l'aide de CRISPR-Cas9. Nous avons également optimisé un protocole de différenciation basé sur l'expression de la neurogénine-2 pour produire des neurones dérivés d'iPSC humains (hiNs). Ce modèle permettra d'évaluer l'effet du génotype rs28834970 sur la liaison de C/EBPβ, l'expression endogène de PTK2B et son impact sur les marqueurs de la MA, notamment la phosphorylation de tau, le métabolisme d'APP et les dysfonctionnements synaptiques aux niveaux structurel et fonctionnel. Ce projet aidera à clarifier le rôle du facteur de risque génétique PTK2B dans les mécanismes étiologiques de la MA.

Alzheimer's disease (AD) is the most common form of dementia and the seventh leading cause of death worldwide, affecting over 35 million people. AD is characterized by two main hallmarks: senile plaques resulting from Aβ extracellular accumulation and neurofibrillary tangles caused by the intra neuronal accumulation of hyperphosphorylated tau protein. These changes lead to synaptic loss and neuronal death. In over 99% cases, AD results from the interaction between environmental factors and genetic risk factors. In these multifactorial cases, genetics is known to play a major role with heritability estimated at between 58% and 79% (Gatz et al., 2006). Consequently, researchers have focused on identifying genetic risk factors through Genome-Wide Association Studies (GWAS), which have associated 76 loci with AD risk, including the locus containing the PTK2B gene (Bellenguez, et al. Nat Genet. 2022.). PTK2B gene is highly expressed in the human brain, particularly in microglia and glutamatergic neurons. It encodes a protein called Pyk2, a non-receptor tyrosine kinase belonging to the focal adhesion pathway. In neurons, Pyk2 plays a role in synapse stabilization through the interaction with scaffold protein such as PSD-95 and in synaptic plasticity by regulating NMDA receptors through phosphorylation. In the context of AD, studies of underlying mechanisms suggest a complex contribution with involvement in amyloid toxicity and tauopathy, combined with possible functional deficits in neurons. However, whether PTK2B under- or overexpression is deleterious remains unclear. Therefore, identifying the functional PTK2B variants could help to understand better understand the pathophysiological mechanisms. This study aims to characterize the functional impact of seven PTK2B variants associated with increased AD risk through in silico and in vitro approaches. Since these variants are located in a cis-regulatory region, they likely affect gene expression rather than protein function. Bioinformatic analyses combined with luciferase assays and Electrophoretic Mobility Shift Assays in SH-SY5Y cells overexpressing C/EBPβ suggest that the rs28834970 C risk allele enhances C/EBPβ binding in a cis-regulatory region of PTK2B, potentially repressing its expression. To validate these findings and assess the variant's impact on PTK2B expression and AD-related phenotypes, we generated isogenic induced pluripotent stem cells (iPSCs) differing only at rs28834970 using CRISPR-Cas9. Additionally, we optimized a neurogenin-2-mediated differentiation protocol to produce human iPSC-derived neurons (hiNs). This model will enable us to investigate the impact of rs28834970 genotype in neurons on C/EBPβ binding, PTK2B endogenous expression, and downstream AD hallmarks, including tau phosphorylation, APP metabolism, and synaptic dysfunction at structural and functional levels. This project should clarify how PTK2B is involved in the etiological mechanisms of AD.