Apport de l'imagerie microscopique multiplex et de l'étude bio-informatique dans l'analyse phénotypique et fonctionnelle du Macrophage tissulaire au cours des pathologies inflammatoires humaines

Contribution of multiplex microscopic imaging and bioinformatics study in the phenotypic and functional analysis of tissue macrophage in human inflammatory pathologies

• Auteur / Autrice : Damien Brisou
• Direction : Cécile Contin-bordes
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Microbiologie - immunologie
• Date : Inscription en doctorat le 01/11/2022
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Dechanet-Merville
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Origins and pathogenesis of autoimmune and inflammatory disorders

Mots clés

Mots clés libres

Macrophages

Microenvironnement tissulaire

Auto-immunité

Intervillite chronique

Sclérodermie

Obésité

Macrophages

Tissue microenvironment

Autoimmunity

Chronic intervillitis

Scleroderma

Obesity

Résumé

Les macrophages sont des cellules essentielles au maintien de l'homéostasie tissulaire, ils répondent aux agressions infectieuses ou stériles, activent l'immunité adaptative, phagocytent les cellules apoptotiques et réparent les tissus . Ils peuvent être résidents, ou dériver des monocytes sanguins, auquel cas ils se différencient et se polarisent en fonction des signaux du micro-environnement tissulaire. Un de leur rôle primordiaux est l'élimination des « Damage-associated Molecular Patterns » (DAMPs), molécules associées à des signaux de danger, qui activent les « Pattern Recognition Receptors » (PRR) des macrophages. Cette interaction initie la voie de l'inflammasome, complexe protéique intracellulaire, qui induit un état activé et provoque la synthèse de cytokines pro inflammatoires (IL-1β, TNF- α…) . Des expériences de différenciation et de polarisation in vitro, via des cytokines et/ou des facteurs de croissance, ont permis de classer les macrophages en deux grands phénotypes associés à des fonctions effectrices distinctes. Ainsi sont décrits le type 1 (M1), pro inflammatoire et le type 2 (M2), associé à la régulation de l'inflammation et la réparation tissulaire . Toutefois, la différenciation macrophagique au sein des tissus résulte d'un continuum dépassant largement cette dichotomie . Elle autorise une grande plasticité d'adaptation des fonctions effectrices en équilibre avec le microenvironnement afin d'assurer l'homéostasie tissulaire. Au laboratoire ImmunoConcEpT, plusieurs équipes s'intéressent à mieux comprendre comment le microenvironnement tissulaire module les propriétés phénotypiques et fonctionnelles des monocytes/macrophages dans des pathologies inflammatoires diverses telles que l'obésité, l'intervillite ou la sclérodermie systémique. Objectifs généraux de la thèse : - Répondre à des besoins de recherche précis autours de l'orientation phénotypique du macrophage dans chacune des maladies et dans leur contexte tissulaire propre - Définir un modèle commun pour l'étude du macrophage tissulaire, ses interactions au sein d'un microenvironnement, qui puisse servir de base pour faciliter l'interprétation des données de façon polyvalente - Élaborer une méthodologie d'étude atours des techniques multiplex/ multiparamétriques en intégrant une approche bio-informatique adaptée aux nouveaux besoins, sur un axe de développement informatique. Description des axes de recherche et questions spécifiques posées : 1. Modèle de l'intervillite chronique d'étiologie indéterminée : Il s'agit d'une pathologie rare du placenta, volontiers récurrente . Elle est caractérisée par une altération des échanges au niveau de la barrière placentaire et est responsable de complications obstétricales sévères : fausses couches spontanées précoces, retards de croissance intra-utérin (souvent sévères et parfois précoces), mort fœtale in utero… Chez ces patientes les chances d'une naissance vivante à terme sont fortement compromises . Cette pathologie se caractérise, sur un plan anatomopathologique, par un infiltrat leucocytaire dans la chambre intervilleuse principalement macrophagique (80%) et lymphocytaire (20%), potentiellement responsable d'une nécrose trophoblastique et de de dépôts fibrinoïdes sur l'arbre villositaire. L'importance de l'infiltrat macrophagique est corrélée au pronostic obstétrical . Au sein d'ImmunoConcEpT, l'équipe du Pr Estibaliz Lazaro a montré, par analyse transcriptomique de ces placentas, qu'il se dégage une signature de type « inflammasome ». Le blocage spécifique de cette voie de transcription par l'Anakinra (antagoniste du récepteur l'IL1-β) protège de la récurrence de l'intervillite, et permet à ces patientes de mener une grossesse à terme d'un nouveau-né eutrophe. Sur le plan tissulaire, l'analyse microscopique de ces placentas confirme l'absence de récidive des lésions d'intervillite avec disparition complète de l'infiltrat macrophagique. Ce modèle met en avant l'importance du macrophage dans la physiopathologie et montre comment la suppression de l'activation via l'inflammasome fait régresser les troubles. La polarisation de ces macrophages n'a jamais été étudiée, or on sait qu'elle change du début (plutôt M1) à la fin de la grossesse (M2), et que certaines maladies obstétricales sont associées à des troubles de cette polarisation (prééclampsie, RCIU, perte fœtale...). Il apparaît donc important de l'étudier dans des placentas souffrant d'intervillite chronique afin de mieux comprendre leur dynamique et leurs déterminants tissulaires. Pourrions-nous identifier une polarisation de type « pathogénique » ? 2. Modèle du macrophage M2 polarisé par les cellules endothéliales dans la sclérodermie : La physiopathologie de la sclérodermie n'est pas totalement élucidée et fait intervenir des interactions de plusieurs acteurs dans un système complexe, qui se compose : d'une activation auto-immune, de modifications des cellules endothéliales de la microcirculation, et d'une activation chronique des fibroblastes conduisant à la fibrose . Au sein d'ImmunoConcEpT, l'équipe du Dr Cécile Bordes a mis en évidence une nouvelle boucle physiopathologique dans la fibrose au cours de la sclérodermie. Cette dernière implique la sécrétion, par les cellules endothéliales microvasculaires, de facteurs pro-fibrosants et modulateurs de la différenciation macrophagique, et ce notamment sous l'influence de l'IL1-β relargué par les plaquettes - . Cette étude combine une approche in vitro et une étude sur des échantillons de patients par microscopie et par analyse transcriptomique. Le volet in vitro montre que des cellules endothéliales de la microcirculation, si elles sont pré-activées par de l'IL1-β, induisent la polarisation des macrophages vers un phénotype M2 (DC-SIGN+), à partir de monocytes de sujets sains. Et si l'on prend des cellules endothéliales purifiées de la peau de patients sclérodermiques, comparé à celle de sujets sains, la polarisation est orientée vers un sous type mixte M1-M2 « sclérodermique » particulier ne produisant pas d'IL10, mais des taux plus élevés de CCL2 et CXCL8. Ces macrophages « sclérodermiques » ainsi différenciés, si on les met en coculture avec des fibroblastes de donneurs sains, auront la capacité à induire un profil fonctionnel pro inflammatoire aux fibroblastes. Dans le volet de l'étude des échantillons des patients, l'analyse transcriptomique mise au point à partir des données de l'étude in vitro, trouve un profil similaire parmi les patients ayant un score de fibrose élevé. L'analyse microscopique de coupes tissulaires par immunofluorescence multiplex (CD68, DC-SIGN, cMAF) montre que ces patients, aux scores de fibrose élevé, présentent un taux de macrophages périvasculaires exprimant DC-SIGN plus élevé que chez des sujets sains ou aux scores de fibrose faible. Il s'agit d'un argument supplémentaire pour incriminer les cellules endothéliales microvasculaires dans la polarisation des macrophages vers un profil pro fibrosant. Des études récentes in vitro et sur des prélèvements de peau de sujets malades menées au laboratoire montrent des altérations des fonctions d'éfférocytose macrophagique induits par les cellules endothéliales. Il s'agit du processus d'élimination des cellules apoptotiques au sein des tissus, indispensable au maintien de l'homéostasie , et dont la défaillance peut contribuer à l'état pro inflammatoire par le biais de l'augmentation tissulaire de la charge apoptotique. Par ailleurs, des résultats transcriptomiques préliminaires mettent en évidence des altérations d'expression génique de plusieurs protéines impliquées dans le processus d'éfférocytose et/ou sa régulation. Pour ce projet, une technique de multiplexage utilisant l'imagerie par cytométrie de masse (Hyperion) est prévue sur des biopsies de patients et de donneurs sains (contrôle), afin de caractériser l'expression de marqueurs d'éfférocytose (CMKLR1, CD91, CD36, CD36, MERTK…), de cytokines anti- et proinflammatoires (IL-10, TGF-β, TNF-α, IL-6, IL-12). Sur la même coupe, les charges apoptotiques endothéliale (CD31+caspase3 clivée+) et fibroblastique (FSP-1+ caspase3 clivée+) seront évaluées ainsi que l'expression de molécules modulant les capacités d'éfférocytose des macrophages, telles que le CD47. Ce projet sera réalisé en collaboration avec le Pr Divi Cornec, responsable de la plateforme Hyperion de l'Université de Brest. Il permettra de mieux cartographier les anomalies d'expression de facteurs membranaires et/ou solubles impliquées dans l'éfférocytose dans la peau sclérodermique et d'apporter des informations importantes sur les interactions physiques et fonctionnelles entre cellules stromales et macrophages. Il viendra compléter les études en cours des anomalies de l'éfférocytose in vitro et dans des modèles animaux de sclérodermie systémique (thèse de science Agathe Depaire, CIFRE ImmunoConcEpT). 3. Rôle des DNAses de l'inflammation induite par l'obésité : L'obésité est responsable de complications métaboliques (diabète, stéatose hépatique, athérosclérose) et représente un problème majeur de santé publique. Elle provoque une inflammation chronique à bas bruit, ou « méta-inflammation », en témoigne l'infiltration du tissu adipeux par des cellules inflammatoires qui influence la survenue des complications . De l'ADN du soi est relargué dans les tissus sous des formes variées suite à la mort cellulaire, comme observé pour les hépatocytes, les adipocytes et les polynucléaires (NETose). Les fragments d'ADN, jouant le rôle de « DAMPs », contribuent à l'inflammation tissulaire en activant les récepteurs spécifiques de l'immunité innée en particulier dans les macrophages (PRR intracytoplasmiques) . Ce phénomène peut être aggravé par un défaut d'éfférocytose ou par une baisse de la capacité à dégrader l'ADN au sein de ces cellules . Il se produit en conséquence une activation de la voie de l'inflammasome puis un enrichissement du microenvironnement en macrophages de type M1-like et un appauvrissement en type M2-like, faisant pencher la balance cytokinique vers un caractère pro-inflammatoire (TNF- α et IL-1β). Ainsi, l'ADN des cellules apoptotiques est responsable du développement des complications de l'obésité, comme le syndrome métabolique ou la stéato-hépatite non alcoolique (NASH), via l'activation du TLR9 (« Toll like receptors 9 ») au sein des cellules immunitaires innées. A contrario, la délétion du TLR9 chez la souris protège contre ces mêmes complications . Des enzymes neutralisant les ADN, les DNAses, sont naturellement produites pour protéger la cellule des conséquences de l'accumulation de l'ADN et préviennent l'activation des récepteurs spécifiques. La « DNAse1L3 » est produite spécifiquement par les cellules inflammatoires infiltrant les tissus métaboliques, et en particulier par les macrophages . Dans un modèle murin d'obésité induit par un régime hypercalorique, mis au point par l'équipe ImmunoConcEpt de Vanja Sisirak, les souris déficientes en « DNase1L3 » (KO) prennent plus de poids que les souris-contrôle (Wild Type, WT). Le déficit en « DNAse1L3 » est responsable d'une accumulation de masse grasse, et aussi du développement d'altérations métaboliques, incluant l'intolérance au glucose, l'insulino-résistance, et la stéatose hépatique. L'infiltrat inflammatoire du tissu adipeux viscéral des souris « DNase1L3-KO » soumise au régime hypercalorique a été étudié par cytométrie de flux. Elle met en évidences une accumulation de macrophages totaux, et un enrichissement en type M1-like (CD11c+) pro-inflammatoire. En parallèle, une étude sanguine chez des patients obèses a montré une diminution de l'activité « DNAseE1L3 » plasmatique et une augmentation des ADN circulants solubles, qui était corrélée à l'Indice de Masse Corporelle (IMC, poids/taille2). Par ailleurs la chirurgie bariatrique permet de normaliser les taux d'ADN circulant. Au total, la « DNAseE1L3 » prévient l'inflammation et les complications métaboliques liés à l'obésité en limitant l'accumulation et l'effet des ADN circulants sur l'activation macrophagique. Il est important d'étudier précisément la polarisation des macrophages dans les tissus adipeux et hépatiques avec ou sans la déficience en « DNAseE1L3 ». Elle permettra d'évaluer finement l'impact de la DNase sur la régulation phénotypique et fonctionnelle du macrophage, et d'étudier son association à une signature transcriptomique inflammatoire particulière. D'autant plus que des études récentes de « single cell RNA sequencing » ont montré l'existence d'un phénotype particulier de macrophages dans la graisse de sujets obèses qui protègerait des complications métaboliques .

Macrophages are essential cells for maintaining tissue homeostasis, they respond to infectious or sterile attacks, activate adaptive immunity, phagocytose apoptotic cells and repair tissues. They can be resident, or derive from blood monocytes, in which case they differentiate and polarize according to signals from the tissue microenvironment. One of their primary roles is the elimination of "Damage-associated Molecular Patterns" (DAMPs), molecules associated with danger signals, which activate the "Pattern Recognition Receptors" (PRR) of macrophages. This interaction initiates the inflammasome pathway, an intracellular protein complex, which induces an activated state and causes the synthesis of pro-inflammatory cytokines (IL-1β, TNF-α, etc.). Differentiation and polarization experiments in vitro, via cytokines and/or growth factors, have made it possible to classify macrophages into two major phenotypes associated with distinct effector functions. Thus are described type 1 (M1), pro-inflammatory and type 2 (M2), associated with the regulation of inflammation and tissue repair. However, macrophage differentiation within tissues results from a continuum far beyond this dichotomy. It allows a great plasticity of adaptation of the effector functions in balance with the microenvironment in order to ensure tissue homeostasis. In the ImmunoConcEpT laboratory, several teams are interested in better understanding how the tissue microenvironment modulates the phenotypic and functional properties of monocytes/macrophages in various inflammatory pathologies such as obesity, intervillitis or systemic sclerosis. General objectives of the thesis: - Respond to specific research needs around the phenotypic orientation of the macrophage in each of the diseases and in their own tissue context - Define a common model for the study of the tissue macrophage, its interactions within a microenvironment, which can serve as a basis to facilitate the interpretation of data in a versatile way - Develop a study methodology around multiplex / multiparametric techniques by integrating a bioinformatics approach adapted to new needs, on an axis of computer development. Description of research areas and specific questions asked: 1. Model of chronic intervillitis of undetermined etiology: This is a rare pathology of the placenta, readily recurrent. It is characterized by an alteration of exchanges at the placental barrier and is responsible for severe obstetric complications: early spontaneous miscarriages, intrauterine growth retardation (often severe and sometimes early), fetal death in utero In these patients the chances of a full-term live birth are greatly compromised. This pathology is characterized, on an anatomopathological level, by a leukocyte infiltrate in the intervillous chamber, mainly macrophage (80%) and lymphocyte (20%), potentially responsible for trophoblastic necrosis and fibrinoid deposits on the villous tree. The importance of the macrophage infiltrate is correlated with the obstetrical prognosis. Within ImmunoConcEpT, Prof. Estibaliz Lazaro's team has shown, by transcriptomic analysis of these placentas, that an "inflammasome" type signature emerges. The specific blocking of this transcription pathway by Anakinra (antagonist of the IL1-β receptor) protects against the recurrence of intervillitis, and allows these patients to carry a pregnancy of a eutrophic newborn to term. On the tissue level, the microscopic analysis of these placentas confirms the absence of recurrence of the intervillilite lesions with complete disappearance of the macrophage infiltrate. This model highlights the importance of the macrophage in pathophysiology and shows how the suppression of activation via the inflammasome reverses the disorders. The polarization of these macrophages has never been studied, but we know that it changes from the beginning (rather M1) to the end of pregnancy (M2), and that certain obstetric diseases are associated with disorders of this polarization (preeclampsia , IUGR, fetal loss, etc.). It therefore seems important to study it in placentas suffering from chronic intervillitis in order to better understand their dynamics and their tissue determinants. Could we identify a “pathogenic” type polarization? 2. Model of the macrophage M2 polarized by endothelial cells in scleroderma: The pathophysiology of scleroderma is not fully understood and involves the interactions of several actors in a complex system, which consists of: autoimmune activation, modifications of the endothelial cells of the microcirculation, and activation chronic fibroblasts leading to fibrosis. Within ImmunoConcEpT, the team of Dr. Cécile Bordes has highlighted a new physiopathological loop in fibrosis during scleroderma. The latter involves the secretion, by microvascular endothelial cells, of pro-fibrotic factors and modulators of macrophage differentiation, particularly under the influence of IL1-β released by platelets - . This study combines an in vitro approach and a study on patient samples by microscopy and transcriptomic analysis. The in vitro part shows that endothelial cells of the microcirculation, if they are pre-activated by IL1-β, induce the polarization of macrophages towards an M2 phenotype (DC-SIGN+), from monocytes of healthy subjects. And if we take endothelial cells purified from the skin of scleroderma patients, compared to those of healthy subjects, the polarization is oriented towards a particular "sclerodermic" mixed M1-M2 subtype that does not produce IL10, but levels higher than CCL2 and CXCL8. These "sclerodermic" macrophages thus differentiated, if they are placed in coculture with fibroblasts from healthy donors, will have the capacity to induce a pro-inflammatory functional profile in the fibroblasts. In the part of the study of the patient samples, the transcriptomic analysis developed from the data of the in vitro study, finds a similar profile among the patients with a high fibrosis score. Microscopic analysis of tissue sections by multiplex immunofluorescence (CD68, DC-SIGN, cMAF) shows that these patients, with high fibrosis scores, have a higher rate of perivascular macrophages expressing DC-SIGN than in healthy subjects or with high fibrosis scores. weak fibrosis. This is an additional argument to incriminate microvascular endothelial cells in the polarization of macrophages towards a pro-fibrotic profile. Recent studies in vitro and on skin samples from diseased subjects carried out in the laboratory show alterations in macrophage efferocytosis functions induced by endothelial cells. This is the process of elimination of apoptotic cells within the tissues, essential for maintaining homeostasis, and the failure of which can contribute to the pro-inflammatory state through the tissue increase in the apoptotic load. Furthermore, preliminary transcriptomic results highlight alterations in the gene expression of several proteins involved in the efferocytosis process and/or its regulation. For this project, a multiplexing technique using mass cytometry imaging (Hyperion) is planned on biopsies from patients and healthy donors (control), in order to characterize the expression of efferocytosis markers (CMKLR1, CD91, CD36, CD36, MERTK, etc.), anti- and pro-inflammatory cytokines (IL-10, TGF-β, TNF-α, IL-6, IL-12). On the same section, endothelial (CD31+ cleaved caspase3+) and fibroblast (FSP-1+ cleaved caspase3+) apoptotic loads will be evaluated as well as the expression of molecules modulating the efferocytosis capacities of macrophages, such as CD47. This project will be carried out in collaboration with Pr Divi Cornec, head of the Hyperion platform at the University of Brest. It will make it possible to better map the anomalies in the expression of membrane and/or soluble factors involved in efferocytosis in scleroderma skin and to provide important information on the physical and functional interactions between stromal cells and macrophages. It will complement ongoing studies of efferocytosis abnormalities in vitro and in animal models of systemic sclerosis (Agathe Depaire science thesis, CIFRE ImmunoConcEpT). 3. Role of DNAses in inflammation induced by obesity: Obesity is responsible for metabolic complications (diabetes, hepatic steatosis, atherosclerosis) and represents a major public health problem. It causes low-grade chronic inflammation, or "meta-inflammation", evidenced by the infiltration of adipose tissue by inflammatory cells which influences the occurrence of complications. Self-DNA is released into the tissues in various forms following cell death, as observed for hepatocytes, adipocytes and polymorphonuclear cells (NETose). DNA fragments, playing the role of “DAMPs”, contribute to tissue inflammation by activating specific innate immunity receptors in particular in macrophages (intracytoplasmic PRRs). This phenomenon can be aggravated by a lack of efferocytosis or by a decrease in the ability to degrade DNA within these cells. As a result, there is an activation of the inflammasome pathway followed by an enrichment of the microenvironment in macrophages of the M1-like type and an impoverishment of the M2-like type, tilting the cytokine balance towards a pro-inflammatory character (TNF-α and IL-1β). Thus, the DNA of apoptotic cells is responsible for the development of complications of obesity, such as metabolic syndrome or non-alcoholic steatohepatitis (NASH), via the activation of TLR9 (“Toll like receptors 9”) within innate immune cells. Conversely, the deletion of TLR9 in mice protects against these same complications. DNA neutralizing enzymes, DNAses, are naturally produced to protect the cell from the consequences of DNA accumulation and prevent the activation of specific receptors. “DNAse1L3” is produced specifically by inflammatory cells infiltrating metabolic tissues, and in particular by macrophages. In a mouse model of obesity induced by a high-calorie diet, developed by the ImmunoConcEpt team of Vanja Sisirak, mice deficient in "DNase1L3" (KO) gain more weight than control mice (Wild Type, WT) . DNAse1L3 deficiency is responsible for an accumulation of fat mass, and also for the development of metabolic alterations, including glucose intolerance, insulin resistance, and hepatic steatosis. The inflammatory infiltrate of the visceral adipose tissue of “DNase1L3-KO” mice subjected to the high calorie diet was studied by flow cytometry. It highlights an accumulation of total macrophages, and an enrichment in pro-inflammatory M1-like type (CD11c+). In parallel, a blood study in obese patients showed a decrease in plasma "DNAseE1L3" activity and an increase in soluble circulating DNA, which was correlated with Body Mass Index (BMI, weight/height2). In addition, bariatric surgery can normalize circulating DNA levels. Overall, “DNAseE1L3” prevents inflammation and obesity-related metabolic complications by limiting the accumulation and effect of circulating DNA on macrophage activation. It is important to precisely study the polarization of macrophages in adipose and hepatic tissues with or without DNAseE1L3 deficiency. It will make it possible to finely evaluate the impact of DNase on the phenotypic and functional regulation of the macrophage, and to study its association with a particular inflammatory transcriptomic signature. Especially since recent “single cell RNA sequencing” studies have shown the existence of a particular phenotype of macrophages in the fat of obese subjects which would protect against metabolic complications.