Modulation de la réplication du VIH-1 et régulation par le SRAS-CoV-2 : la kinase GCN2 comme facteur clef de restriction des infections virales

Modulation of HIV-1 replication and regulation by SARS-CoV-2: GCN2 kinase as a key restriction factor of viral infections

• Auteur / Autrice : Chloé Torres
• Direction : Mathieu Metifiot
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Microbiologie - immunologie
• Date : Soutenance en 2024
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Microbiologie fondamentale et Pathogénicité
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Variabilité, réplication et mobilité des Génomes viraux et bactériens
• Jury : Président / Présidente : Patrice Gouet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Mathieu Metifiot, Hélène Munier-lehmann, Charles Bodet
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Hélène Munier-lehmann, Charles Bodet

Mots clés

Mots clés libres

Virus

Résistance

AlphaLISA

Réponse au stress

Interaction protéine-protéine

Molécules

Viruses

Resistance

AlphaLISA

Integrated stress response

Protein-protein interaction

Molecules

Résumé

GCN2 est une kinase cellulaire humaine impliquée dans la réponse au stress intégrée (ISR). Une fois activée, elle phosphoryle le facteur d’initiation de la traduction eIF2α, induisant une inhibition globale de la traduction et favorisant l’expression du facteur de transcription ATF4. Ce dernier active l’expression de gènes impliqués dans l’adaptation au stress ou l’apoptose. GCN2 est un senseur des carences en acides aminés, mais de plus en plus d’études révèlent son implication dans la réponse antivirale de la cellule. En effet GCN2 est activée lors de l’infection par certains virus et sa délétion favorise la réplication virale. Les hypothèses concernant le mode d’activation de la kinase pendant l’infection impliquent des interactions directes avec des facteurs viraux, et des mécanismes liés à la machinerie de traduction. Dans le cas du VIH-1, GCN2 interagit avec l’intégrase (IN) du virus et phosphoryle la sérine 255. L’IN catalyse l’intégration de l’ADN viral dans le génome de l’hôte infecté. Sa phosphorylation par GCN2 diminue l’intégration et par conséquent la réplication. Pour contrecarrer cet effet restrictif de GCN2, les virus ont développé des mécanismes d’échappement. C’est notamment le cas avec le VIH-1 ou encore le SRAS-CoV qui diminuent le niveau de protéines GCN2 pendant l’infection (protéolyse). Dans ce contexte, les objectifs de cette thèse étaient (1) de développer des modulateurs de l’interaction entre GCN2 et l’IN du VIH-1 et d’évaluer le potentiel impact de ces molécules sur la réplication du virus, et (2) d’étudier le rôle de GCN2 lors de l’infection par un autre virus, le SRAS-CoV-2. Après avoir mis en place un test de suivi de l’interaction IN-GCN2 basé sur la technologie AlphaLISA, nous avons criblé 2 chimiothèques différentes et identifié 18 molécules actives. L’étude de la relation structure-activité de ces composés ainsi que la mesure de leur activité en cellules nous a permis d’identifier des structures chimiques qui pourraient servir de base pour le développement d’inhibiteurs de l’interaction. En parallèle, nous avons généré une lignée cellulaire permissive à l’infection par le SRAS-CoV-2 et détecté une régulation négative de la kinase lors de l’infection. Nous avons identifié les partenaires de GCN2 dans ce contexte infectieux, incluant des facteurs viraux et une protéine cellulaire de la voie de dégradation protéique. Nous avons montré que cette voie n’est pas directement responsable de la régulation de GCN2, mais que la kinase pourrait être dégradée par la protéase du SRAS-CoV-2. De nouveaux travaux seront nécessaires afin d’élucider le rôle de GCN2 dans la réplication du SRAS-CoV-2.

GCN2 is a human cellular kinase involved in the integrated stress response (ISR). Once activated, it phosphorylates the translation initiation factor eIF2α, inducing a global inhibition of translation and promoting the expression of the transcription factor ATF4. The latter activates the expression of genes involved in adaptation to stress or apoptosis. GCN2 is a sensor of amino acid starvation, but an increasing number of studies reveal its involvement in the cell's antiviral response. Indeed, GCN2 is activated during infection by different viruses and its deletion enhances viral replication. Hypotheses regarding the mode of kinase activation during infection involve direct interactions with viral factors, and mechanisms linked to the translation machinery. In the case of HIV-1, GCN2 interacts with the viral integrase (IN) which is phosphorylated on its serine 255. IN catalyzes the integration of viral DNA into the genome of the infected host. Its phosphorylation by GCN2 reduces integration and therefore replication. To counteract this restrictive effect of GCN2, viruses have developed escape mechanisms. For example, GCN2 protein level reduces upon infection by HIV-1 or SARS-CoV. In this context, the aims of this thesis were (1) to develop modulators of the interaction between GCN2 and HIV-1 IN and to assess the potential impact of these molecules on viral replication, and (2) to study the role of GCN2 during SARS-CoV-2 infection. After setting up an assay to monitor the GCN2-IN interaction using AlphaLISA technology, we screened 2 different chemical libraries and identified 18 active molecules. The study of their structure-activity relationship as well as the measurement of their activity in cells allowed us to identify chemical structures that could serve as a basis for the development of inhibitors of the interaction. In parallel, we generated a cell line permissive to SARS-CoV-2 infection and detected a downregulation of the kinase upon infection. We then identified GCN2 partners in this context, including viral factors and a cellular protein of the protein degradation pathway. We showed that this pathway is not directly responsible for the regulation of GCN2, but rather that the kinase may be degraded by the SARS-CoV-2 protease. Further work will be necessary to elucidate the role of GCN2 in SARS-CoV-2 replication.