Caractérisation et criblage à haut-débit de communautés bactériennes dans le compost : mécanismes d'antibiorésistance et découverte de nouveaux antibiotiques

Characterization and high-throughput screening of bacterial communities in the compost: mechanisms of antibiotic resistance and discovery of new antibiotics

• Auteur / Autrice : Aysha Chowdhury
• Direction : Paul Rainey
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Chimie Physique
• Date : Inscription en doctorat le 07/02/2022
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Chimie physique et chimie analytique de Paris Centre
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Chimie Biologie et Innovation
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Laboratoire de Biochimie (LBC)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : ESPCI Ecole supérieure de physique et de chimie industrielles de la ville de Paris (PSL)

Mots clés

Mots clés libres

Metagenomique

Évolution

Antibioresistance

Transfert de gènes horizontal

Éléments génétiques mobiles

Metagenomic

Evolution

Antibioresistance

Horizontal gene transfer

Mobile Genetic Elements

Résumé

Le sol est un formidable réservoir de biodiversité et les antibiotiques sont majoritairement des métabolites secondaires, ou des dérivés semi-synthétiques, issus de ces microorganismes. Dansla nature, ces composés servent d'armes dans la compétition entre les espèces, et leur évolutionet dissémination sont intimement liées à celles de l'antibiorésistance. Ce projet vise à i) étudier la diversité fonctionnelle (gènes et voies métaboliques) des communautés microbiennes du sol impliquées dans la production d'antibiotiques et des résistomes correspondants, ii) améliorer la compréhension des processus écologiques et évolutifs des communautés du sol impliquées dans la production d'antibiotiques et par conséquent, aux résistomeassociés, iii) améliorer compréhension du rôle et des mécanismes de transferts de gènes dans l'évolution et la diffusion des antibiotiques et de leur résistance, et iv) découvrir de nouvelles classes d'antibiotiques naturels, en particulier ciblant les pathogènes pour réduire lesrisqued'émergencederésistomes. À cette fin, nous analyserons des échantillons de sol, sélectionnés pour couvrir la plus grande diversité microbienne possible. La diversité génétique associée à l'antibiorésistance et à la production d'antibiotiques sera caractérisée fonctionnellement en utilisant i) des approches métagénomiues ciblées et globales et ii) à l'aide d'une nouvelle plateforme de microfluidique en goutte, un criblage phénotypique et génotypique à très haut débit couplé à un séquençage génomique sur cellule unique. Cela donnera un aperçu sans précédent de la diversité et des interactions entre les molécules antibiotiques et les antibiorésistances, et permettra potentiellement des découvertes dans ces deux domaines. En outre, nous utiliserons ces échantillons de sol, et cette plateforme microfluidique, en combinaison avec un système innovant d'évolution en laboratoire, pour étudier i) le rôle des éléments génétiques naturels égoïstes (SGE) pour l'amplification et la diffusion des gènes associés aux antibiotiques et aux antibiorésistances, ii) les mécanismes qui contrôle l'émergence et la dissémination des résistances, iii) l'émergence de nouveaux clusters de gènes codants pour des antibiotiques ou des résistances en raison d'événements de recombinaison, et iv) l'obtention de nouveaux antibiotiques par l'évolution en laboratoire de communautés microbiennes complexes.Dans le système de microfluidique en gouttes, développé dans ce projet, les micro-organismes seront séparés en cellule unique par goutte. La production d'antibiotiques sera détectée à l'aide de bactéries reportrices fluorescentes développées pour trier en jusqu'à 1000 gouttes par seconde et cribler environ 1 million de micro-organismes par heure. Cette technologie innovante augmentera à la fois le débit (> 100 fois) et la sensibilité du criblage par rapport aux méthodes microbiologiques conventionnelles. Le même système sera également appliqué pour suivre l'antibiorésistance. Dans ce cas les bactéries vivantes seront détectées à l'aide d'un fluorophore permettant dequantifier les cellules vivantes en goutte. Ce système permettra également la sélection d'espèces réputées non cultivables. À cette fin, nous développerons un processus de séquençage génomique sur cellule unique (WGS) de milliers de bactéries triées afin d'identifier les clusters de gènes impliqués dans la production de nouveaux composés antibiotiques, ou dans de nouveaux mécanismesd'antibiorésistance.L'activité des bactéries cultivables triées sera validée sur plusieurs pathogènes. Les molécules actives seront identifiées par spectrométrie de masse et les génomes des souches analysées par NGS. Les clusters de gènes codant potentiellement pour de nouveaux antibiotiques et provenant des bactéries triées, cultivable ou non, seront transférées dans un châssis bactérien pour leur production, leur caractérisation, et le développement potentiel de nouvelles molécules thérapeutiques.

Soil is a formidable reservoir of microbial biodiversity and existing antibiotics are principally secondary metabolites produced by soil microorganisms, or semisynthetic derivatives thereof. In nature, these compounds serve as weapons in the competition between genotypes, and their evolution and dissemination are intimately coupled with the evolution and dissemination of antibiotic resistance. This project aims i) to investigate the functional diversity (genes and metabolic pathways) of soil microbial communities involved in antibiotic production, and corresponding resistomes, ii) to develop a better understanding of ecological and evolutionary processes in the soil communities involved in antibiotic production, and as a consequence, to their associated resistomes, iii) to develop a better understanding of the role and mechanisms of horizontal and vertical gene transfer in the evolution and dissemination of antibiotics and antibiotic resistance, and iv) to discover new natural classes of antibiotics, in particular more pathogen-specific antibiotics that reduce the risk of emergence of adapted resistomes.To this end, we will analyze soil samples, selected to cover the largest microbial diversity possible. The multiplicity of genetic diversity associated with antibiotic production and antibiotic resistance will be functionally characterized using i) targeted and global metagenomic approaches and ii) ultrahigh-throughput phenotypic and genotypic screening and single-cell whole genome sequencing using a novel droplet-based microfluidic platform. This will give unprecedented insight into the diversity of, and interplay between, antibiotic and resistance mechanisms, and potentially allow the discovery of novel antibiotics and resistance mechanisms.Furthermore, we will use the same soil samples, and the same analytical systems, in combination with a powerful new laboratory evolution system, to i) exploit the ability of natural selfish genetic elements (SGEs) to amplify and disseminate antibiotic and resistance genes, ii) study mechanisms to control of the emergence and dissemination of resistance, iii) observe the emergence of new antibiotic and resistance genes and clusters due to recombination events, and iv) use laboratory evolution in highly diverse microbial communities to evolve novel antibiotics. Using the droplet-based microfluidic system, which we will develop during the project, single microorganisms will be compartmentalized in droplets and antibiotic production will be detected using specifically developed reporter bacteria, allowing fluorescence-activated sorting of the droplets at rates of up to 1,000 per second, and screening of ~1 million microorganisms per hour. This innovative technology will increase both screening throughput (>100-fold) and sensitivity compared to conventional microbiological screens. The same system will also be applied to screen for antibiotic resistance, in this case screening in the presence of antibiotic, and using a fluorogenic assay to quantify live bacteria in the drops. Furthermore, it will allow screening of species that are usually considered as non-culturable. To this end, we will develop a system to allow single-cell whole genome sequencing (WGS) of thousands of sorted bacteria to directly identify biosynthetic gene clusters producing new antibiotic compounds or comprising mechanisms of antibiotic resistance. Sorted cultivatable bacteria will be grown to validate antibiotic activity on selected pathogens analysed by mass-spectrometry to identify active molecules and analysed by NGS. Gene clusters potentially encoding novel antibiotics from these bacteria, or from sorted non-cultivatable bacteria will be transferred into a bacterial chassis for production and further characterisation, and potential development into novel therapeutics.