Développement de nouvelles approches d'édition du génome

Development of novel prime editing strategies

• Auteur / Autrice : José Roberto Alvarez vargas
• Direction : Carine Giovannangeli
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Sciences du Cancer
• Date : Inscription en doctorat le 30/09/2022
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cancérologie : biologie-médecine-santé (Villejuif, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de structure et instabilité des génomes (Paris)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : GE2R (Genome Editing, DNA double-strand break Repair and cellular Responses)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université Paris-Saclay. Faculté de médecine (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2020-....)

Mots clés

Mots clés libres

Prime editing

Edition du génome

Réparation de l'ADN

Thérapie génique

Prime editing

Genome editing

Gene therapy

Double-strand break repair

Résumé

Les technologies d'édition du génome utilisant les systèmes CRISPR/Cas permettent d'induire des modifications ciblées dans le génome. Dans de nombreux systèmes biologiques, les séquences ciblées sont efficacement modifiées grâce à la réparation des cassures double brin induites par CRISPR, mais les mutations obtenues sont hétérogènes et la séquence souhaitée est souvent obtenue à faible taux. Différentes stratégies ont été développées pour améliorer l'efficacité de l'édition précise du génome. La manipulation des voies de réparation des cassures, en inhibant les voies de réparation par « end-joining » ou stimulant la réparation de l'ADN dirigée par l'homologie, est un moyen de favoriser l'obtention de la séquence souhaitée par rapport à d'autres modifications (1). D'autres approches récemment décrites, l'édition de bases et le « prime editing », permettent l'édition du génome sans cassures double brin et sans donneur, avec l'utilisation de protéines de fusion entre une Cas9 nickase et une ADN désaminase, ou une transcriptase inverse associée à un ARN guide qui inclut également la séquence du donneur, respectivement. Ces approches peuvent permettre d'obtenir une modification de séquence efficace et précise dans certaines conditions : pour les éditeurs de base, ils permettent uniquement d'induire des mutations ponctuelles et leur précision dépend de la séquence cible (2,3), tandis que pour les « prime éditeurs », leur efficacité varie fortement d'une cible à l'autre, et selon les types cellulaires, et ils ne permettent que des modifications de séquence de courte taille (4). Compte tenu de ces limitations, des « prime éditeur » améliorés sont indispensables. Notre objectif est de développer des « prime éditeurs », plus efficaces et plus sûrs. Nous identifierons les protéines de réparation de l'ADN et les régulateurs qui favorisent ou limitent l'activité de « prime editing » dans différents types de cellules et pour différents types de modifications (par des criblages de gain ou de perte de fonction). Ces données nous permettrons de développer des « prime éditeurs » optimisés. Nous les validerons sur des cibles cliniquement pertinentes pour des stratégies de thérapie génique, et pour des approches d'édition génique en multiplex permettant le développement de cellules CAR-T universelles pour des thérapies anticancéreuses.

Genome editing technologies based on CRISPR/Cas systems allow the targeted modification of a DNA sequence in the genome of cells or organisms. In many biological systems targeted sequences are efficiently modified through double-strand break (DSB) repair but the products are heterogenous and the desired sequence is often obtained at low rate. Different strategies have been developed to enhance the efficiency of precise genome editing. The manipulation of DSB repair pathways, inhibiting end-joining repair pathways or stimulating homology-directed DNA repair, is a way to favor the desired sequence compared to other modifications (1). Other recently described approaches, base editing and prime editing, allow DSB-free and donor-free genome editing, with the use of fusion proteins between a Cas9 nickase and a DNA deaminase or a reverse transcriptase associated with a guide RNA that also includes the donor sequence, respectively. They can allow to obtain efficient and precise sequence change in some specific conditions: for base editors, they can only install 6 point mutations and precision mainly depends on the target sequence (2,3), while for prime editors, efficiency strongly varies from one target to another, and between cell types, and they only allow small sequence changes (4). Given these limitations, improved and alternative prime editing tools are therefore highly needed. Our objectives are to develop alternative, more efficient and safer genome editing tools based on the recently described prime editing strategy. We will identify DNA repair proteins and regulators that either favor or limit prime editing activity in different cell types for different types of edits (by gain- or loss-of-function screens). Based on these data we will develop optimized prime editing tools. We will validate these novel prime editing tools on clinically relevant targets for gene therapy strategies as well as for more efficient multiplex gene editing for the development of universal CAR-T cells in anticancer therapies.