Elucidation de la machinerie enzymatique impliquée dans la biosynthèse d'alcaloïdes indoliques monoterpéniques chez différentes Apocynacées

Elucidation of the enzymatic machinery involved in the biosynthesis of monoterpene indole alkaloids in different Apocynaceae

• Auteur / Autrice : Enzo Lezin
• Direction : Vincent Courdavault, Benoit St-pierre
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Sciences de la Vie et de la Santé
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2022
• Etablissement(s) : Tours
• Ecole(s) doctorale(s) : Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant - SSBCV
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biomolécules et Biotechnologies Végétales

Mots clés

Mots clés libres

Alcaloïde indolique monoterpénique

Apocynacée

Biosynthèse

Validation fonctionnelle d'enzymes

Monoterpene indole alkaloid

Apocynaceae

Biosynthesis

Enzyme functional validation

Résumé

Les plantes de la famille des Apocynacées ont acquis au cours de l'évolution la capacité de produire des alcaloïdes indoliques monoterpéniques (AIM) aux activités biologiques multiples pour lutter face aux stress biotiques et abiotiques. Les AIM ont été décrits comment étant des métabolites spécialisés possédant des propriétés pharmacologiques nombreuses et produits en infime quantité via des voies biosynthétiques longues et complexes. L'objectif est d'obtenir un approvisionnement stable de ces composés d'intérêt sans surexploitation des plantes productrices souvent protégées ou difficilement accessibles. Il est donc nécessaire d'élucider leurs voies de biosynthèse afin de les transférer dans des systèmes hétérologues comme les levures pour créer des cellules usines. Si de nombreuses étapes de biosynthèse des AIM ont été élucidées à ce jour, certaines impliquant des cytochromes P450 (CYP) ou des réductases restent inconnues et sont l'objet d'un projet ANR (MIACYC) porté par le laboratoire BBV (début février 2021). Le présent projet de thèse, inclus dans le projet MIACYC, se proposera d'élucider des voies de biosynthèse de plusieurs AIM d'intérêt chez différentes Apocynacées. L'étude de la cyclisation de la vincamine, un agent vasodilatateur et nootrope, chez Vinca minor ou bien de l'ajmaline, une molécule antiarythmique, chez Rauvolfia tetraphylla font partie intégrante de ce projet de thèse. Des analyses génomiques, transcriptomiques et métabolomiques sur différents tissus de ces plantes sont réalisées. Ces données permettent d'identifier, par homologie de séquence avec des enzymes déjà caractérisées, des enzymes candidates potentiellement impliquées dans la biosynthèse de ces AIM. Les gènes candidats seront ensuite validés par des approches classiques de génomique fonctionnelle (surexpression transitoire, test biochimique utilisant des protéines recombinantes…) afin de reconstituer la séquence enzymatique de biosynthèse. Enfin, les gènes validés seront transférés par des approches CRISPR/Cas9 dans des souches de levures productrices de strictosidine (précurseur universel des AIM) pour établir la preuve de concept de la capacité de production d'AIM, cyclisé ou non, dans ce modèle et l'appliquer, à terme, à des molécules d'intérêt direct.

The plants of the Apocynaceae family have acquired during evolution the ability to produce monoterpene indolic alkaloids (AIM) with multiple biological activities to fight against biotic and abiotic stresses. AIM have been described as being specialized metabolites with numerous pharmacological properties and produced in minute quantities via long and complex biosynthetic pathways. The objective is to obtain a stable supply of these compounds of interest without overexploitation of producing plants often protected or difficult to access. It is therefore necessary to elucidate their biosynthesis pathways in order to transfer them into heterologous systems such as yeasts to create factory cells. If many steps of AIM biosynthesis have been elucidated to date, some involving cytochromes P450 (CYP) or reductases remain unknown and are the subject of an ANR project (MIACYC) led by the BBV laboratory (early February 2021). This thesis project, included in the MIACYC project, will elucidate biosynthesis pathways of several AIM of interest in different Apocynaceae. The study of the cyclization of vincamine, a vasodilator and nootropic agent, in Vinca minor or ajmaline, an antiarrhythmic molecule, in Rauvolfia tetraphylla are an integral part of this thesis project. Genomic, transcriptomic and metabolomic analyses are performed on different tissues of these plants. These data make it possible to identify, by sequence homology with already characterized enzymes, candidate enzymes potentially involved in the biosynthesis of these AIM. The candidate genes will then be validated by classical functional genomics approaches (transient overexpression, biochemical test using recombinant proteins ) in order to reconstitute the enzymatic biosynthesis sequence. Finally, the validated genes will be transferred by CRISPR/Cas9 approaches in strains of yeast producing strictosidine (universal precursor of AIM) to establish the proof of concept of the production capacity of AIM, cyclized or not, in this model and apply it, finally, molecules of direct interest.