Control de la proximité spatiale pour des cascades enzymatiques innovantes afin d'améliorer la déconstruction de la biomasse

Controlled spatial proximity for innovating enzymatic cascades to enhance biomass deconstruction

• Auteur / Autrice : Iker Pardo larrabeiti
• Direction : Claire Dumon, Cédric Montanier
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Ingénieries microbienne et enzymatique
• Date : Inscription en doctorat le 01/12/2022
• Etablissement(s) : Université de Toulouse (2023-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences écologiques, vétérinaires, agronomiques et bioingénieries (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : TBI - Toulouse Biotechnology Institute, Bio & Chemical Engineering
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : CIMEs - Catalyse et ingénierie moléculaire enzymatiques
• Partenaire(s) de recherche : établissement délivrant conjointement le doctorat : Institut national des sciences appliquées (Toulouse ; 1961-....)

Mots clés

Mots clés libres

Proximité spatiale

Xylanase

Xylosidase

Bio Molecular Welding

Spatial proximity

Xylanase

Xylosidase

Bio Molecular Welding

Résumé

Aujourd'hui, l'augmentation du CO2 atmosphérique est due à l'utilisation de carbone fossile dans notre vie quotidienne. Outre le développement de sources d'énergie alternatives (solaire, éolienne, nucléaire), la biomasse végétale est l'une des principales options pour remplacer le carburant dans le secteur des transports. Ainsi, la biomasse végétale est appelée à jouer un rôle important dans cette stratégie européenne de bioéconomie. Les biocarburants de deuxième génération reposent sur un matériau non alimentaire bon marché et abondant : la lignocellulose (LC). La LC est constituée d'un réseau complexe de cellulose, d'hémicelluloses, de lignine et de protéines qui se réticulent les unes aux autres et est très récalcitrante à la dégradation chimique ou biologique. Cependant, cette complexité chimique offre un vaste potentiel dans le développement de la bioraffinerie pour des molécules et des matériaux renouvelables et durables pour notre vie quotidienne. Dans la nature, les microorganismes lignocellulolytiques sont capables de métaboliser et de recycler le carbone organique d'origine végétale. Ils y parviennent en utilisant des arsenaux complexes d'enzymes dégradant la paroi cellulaire. La plupart de ces enzymes présentent une architecture modulaire, composée de modules catalytiques et non catalytiques. Certaines bactéries anaérobies produisent un complexe multienzymatique auto-assemblé ancré à la membrane externe qui couple des enzymes aux activités complémentaires. Des travaux antérieurs ont démontré que la proximité spatiale est une clé de l'efficacité remarquable du cellulosome, mais il est difficile d'évaluer l'effet de la distance et de l'orientation du site actif sur la synergie enzymatique, principalement en raison de la grande flexibilité du cellulosome. Ainsi, le contrôle de cette organisation spatiale est d'une grande importance pour maîtriser la synergie enzymatique et augmenter le rendement de la déconstruction du PCW. Pour atteindre cet objectif, une approche originale est nécessaire. CONCERTO propose d'utiliser l'outil BioMolecular Welding, composé de deux petites protéines Jo et In qui sont capables de créer spontanément une liaison isopeptidique intramoléculaire. Une fois liées l'une à l'autre, Jo-In forment un complexe rigide d'environ 6 nm de large, présentant des extrémités N- et C- disponibles pour la fusion. En outre, l'organisation antiparallèle de Jo-In offre la possibilité de créer des chimères et de moduler l'organisation spatiale relative des domaines protéiques liés. Cependant, cette technologie est limitée car il n'existe qu'une seule paire de Jo-In et aucune paire complémentaire naturelle. Cette limitation empêche le développement d'assemblages plus complexes qui sont nécessaires pour dégrader la CL. Par conséquent, dans CONCERTO, nous proposons d'aborder cette limitation en développant de nouvelles paires de Jo et In afin de créer une plus grande organisation d'enzymes multi-modulaires. Grâce aux nouvelles paires de Jo et In, des complexes enzymatiques originaux seront conçus dans CONCERTO et seront étudiés en profondeur, d'une part en résolvant la structure de ces complexes en solution en utilisant l'analyse SAXS et d'autre part en caractérisant soigneusement le profil de produit généré par ces complexes enzymatiques grâce au développement d'une stratégie analytique qui n'existe pas aujourd'hui. Nous émettons l'hypothèse que différentes organisations spatiales modifieront le profil de produit de l'hydrolyse de substrats complexes de parois cellulaires végétales, ce qui nous aidera à comprendre la relation activité catalytique/organisation spatiale/profil de produit au sein de la nanomachine et ouvrira la voie vers le contrôle de la déconstruction de la biomasse.

Today, the increase of the atmospheric CO2 originates from the utilisation of carbon fossil in our daily life. In addition to the development of alternative energy sources (solar, wind, nuclear), plant biomass is one of the main options to replace fuel for transportation sector. Thus, plant biomass is projected to play an important role in this European bioeconomy strategy. The second-generation biofuels relies on a cheap and abundant non-food material: the lignocellulose (LC). LC consists of a complex network of cellulose, hemicelluloses, lignin and proteins that cross-link with each other and is highly recalcitrant to chemical or biological degradation. However, this chemical complexity offers a vast potential in the development of biorefinery for renewable and sustainable molecules and materials for our daily lives. In Nature, lignocellulolytic microorganisms are able to metabolize and recycle plant-derived organic carbon. They achieve this by using complex arsenals of cell wall-degrading enzymes. Most of these enzymes display a modular architecture, composed of catalytic and non-catalytic modules. Some anaerobic bacterium produce a self-assembling multienzymatic complex anchored to the outer membrane that couple enzymes with complementary activities. Previous work has evidenced that spatial proximity is a key to the remarkable efficiency of the cellulosome but it is difficult to evaluate the effect of the distance and active site orientation on enzymatic synergism mainly because of the high flexibility of the cellulosome. Thus, controlling such spatial organization is of high importance to master enzymatic synergism and increase the efficiency yield of PCW deconstruction. To reach this goal, an original approach is required. CONCERTO propose to use the BioMolecular Welding tool, composed of two small proteins Jo and In that are able to spontaneously create an intramolecular isopeptidic bond. Once linked to each other, Jo-In is a rigid complex of around 6 nm wide, displaying available N- and C-terminus for fusion. Furthermore, the anti-parallel organization of Jo-In offers the ability to create chimeras and modulate the relative spatial organization of linked protein domains. However this technology is limited because there is only one pair of Jo-In, and no natural complementary pair exists. This limitation prevents from the development of more complex assemblies that are required to degrade LC. Therefore, in CONCERTO, we propose to tackle this limitation by developing new pair of Jo and In in order to create larger organization of multi-modular enzymes. Thanks to new pairs of Jo and In, original enzymatic complexes will be designed in CONCERTO and will be deeply investigating, on one hand by solving the structure of theses complexes in solution using SAXS analysis and on another hand by carefully characterising the product profile generated by such enzymatic complexes thanks to the development of an analytical strategy that does not exists today. We hypothesize that various spatial organization will alter the product profile of the hydrolysis of complex plant cell wall substrates, helping us to understand the catalytic activity/spatial organization/product profile relationship within nanomachine and paved the way toward the control of biomass deconstruction.