Etude ex vivo et in vitro de l'adhésion bactérienne et de la formation de biofilm à la surface des prothèses vasculaires infectées

Ex vivo and in vitro study of bacterial adhesion and biofilm formation on the surface of infected vascular grafts

• Auteur / Autrice : Mathilde Puges
• Direction : Charles Cazanave
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie - immunologie
• Date : Soutenance le 08/12/2023
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Microbiologie fondamentale et pathogénicité (Bordeaux)
• Jury : Président / Présidente : Geneviève Héry-Arnaud
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Matthieu Revest, Sébastien Deglise, Rozenn Le Berre, Florent Valour
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Matthieu Revest, Sébastien Deglise

Mots clés

Mots clés contrôlés

Bactéries -- Adhésivité

Staphylocoque doré

Prothèses internes

Infections de prothèses articulaires

Biofilms

Mots clés libres

Biofilm

Infection de prothèses et endoprothèses vasculaires

Staphylococcus aureus

Adhésion

Biofilm

Vascular graft and endograft infections

Staphylococcus aureus

Adhesion

Résumé

Les infections de prothèses et endoprothèses vasculaires (IPEV) sont des infections sévères, dont le pronostic est grevé d’une forte morbi-mortalité et d’un taux de rechute important.Ces échecs fréquents de traitement sont notamment liés à l’adhésion bactérienne sur le matériel vasculaire puis à la formation de biofilm permettant un échappement vis-à-vis du système immunitaire et au traitement antibiotique. Ce biofilm est mal caractérisé dans les IPEV et de nombreux principes du traitement sont déclinés du traitement des infections de prothèses ostéo-articulaires, malgré une physiopathologie très différente.Nous avons donc mené un projet tiré des questions qui découlent de notre activité clinique auprès de ces patients, de l’ex vivo à l’in vitro en étudiant Staphylococcus aureus, bactérie très fréquemment impliqué dans les IPV et associé à une forte production de biofilm.Toutes les prothèses vasculaires déposées au CHU de Bordeaux ont été recueillies d’une part pour imager le biofilm en microscopie électronique à balayage (MEB), d’autre part pour tenter d’améliorer le diagnostic microbiologique des IPEV. L’imagerie ex vivo des prothèses infectées a permis de visualiser une matrice très dense et adhérente de biofilm associée à de la fibrine, au sein de laquelle se logeaient les micro-organismes, dès un mois après le début de l’infection. Même la sonication ne permettait pas de complètement déloger biofilm et microorganismes de la surface de la prothèse. Aucune différence significative de conformation et de densité du biofilm, ni de quantité de microorganismes n’a été retrouvée entre les deux faces des prothèses. Ce caractère très dense du biofilm explique probablement l’importance de la dépose prothétique dans les IPEV.Le liquide de sonication d’une autre partie des prothèses déposées a été ensemencé dans des flacons d’hémocultures, ce qui a permis une accélération du délai de pousse pour certains patients et l’identification de microorganismes supplémentaires par rapport à la culture conventionnelle du liquide de sonication. Ces deux techniques pourraient être utilisées conjointement afin d’améliorer la sensibilité et le délai du diagnostic microbiologique de IPEV.Nous avons ensuite cherché à évaluer in vitro l’adhésion et la formation de biofilm par S. aureus à la surface de différents matériaux de prothèse vasculaire, du polyester recouvert de gélatine ou collagène plus ou moins associé à des substances anti-microbiennes, argent et triclosan. Trois souches de S. aureus ont été étudiées, une souche de référence formant du biofilm, et deux souches cliniques, une responsable d’IPEV et l’autre responsable de bactériémie sans infection de matériel. Plusieurs techniques ont pour cela été utilisées, afin d’évaluer les capacités d’adhésion et de formation de biofilm par coloration au crystal violet et test métabolique, la disposition et la conformation du biofilm en MEB, et la viabilité bactérienne à la surface des prothèses par culture après sonication. Les prothèses imprégnées d’argent et de triclosan ont montré une nette supériorité pour prévenir l’adhésion et la formation de biofilm par rapport à toutes les autres prothèses. Le revêtement en gélatine semblait mieux résister à la colonisation de S. aureus par rapport au collagène, et l’argent seul semblait paradoxalement favoriser la formation de biofilm, peut être un effet paradoxal lié à un effet inoculum. La phase très initiale de l’adhésion de S. aureus sur la surface des différentes prothèses vasculaires a quant à elle été évaluée par microscopie de force atomique et les résultats sont en cours d’analyse.

Vascular graft and endograft infections (VGEIs) are severe infections, with a prognosis burdened by high morbidity and mortality rates and a significant recurrence rate. These frequent treatment failures are mainly attributed to bacterial adhesion on vascular materials and the subsequent formation of a biofilm that allows evasion from the immune system and antibiotic treatment. This biofilm is poorly characterized in VGEIs, and many treatment principles are adapted from bone and joint infections management, despite a very different pathophysiology.Therefore, we conducted a project based on questions arising from our clinical work, from ex vivo to in vitro studies involving Staphylococcus aureus, a bacterium frequently implicated in VGEIs and associated with high biofilm production. All vascular grafts removed at Bordeaux University Hospital were collected, firstly to visualize the biofilm using scanning electron microscopy (SEM) and secondly, to attempt to improve the microbiological diagnosis of VGEIs.Ex vivo imaging of infected grafts revealed a dense and adherent biofilm matrix associated with fibrin, within which microorganisms were embedded. Even sonication did not completely dislodge the biofilm and microorganisms from the grafts’ surface. No significant differences in biofilm conformation, density, nor microorganism quantity were found between the two sides of the grafts. This dense biofilm likely explains the importance of graft removal in VGEIs.The sonicate fluid from another portion of removed prostheses was inoculated into blood culture bottles, which accelerated the delay to positivity for some patients and identified additional microorganisms compared to conventional sonication fluid culture. These two techniques could be used together to improve the sensitivity and delay of the microbiological diagnosis of VGEIs.Next, we sought to evaluate in vitro the adhesion and biofilm formation by S. aureus on the surface of different vascular grafts materials, including polyester coated with gelatin or collagen, with or without antimicrobial substances such as silver and triclosan. Three strains of S. aureus were studied: a reference strain capable of biofilm formation, and two clinical strains, one responsible for VGEI and the other for a bloodstream infection without foreign material infection. Several techniques were used to assess adhesion and biofilm formation capacities, including crystal violet staining and metabolic testing, biofilm structure and conformation through SEM, and bacterial viability on the graft surface through sonicate fluid culture. Grafts impregnated with silver and triclosan showed clear superiority in preventing adhesion and biofilm formation compared to all other grafts. Gelatin coating appeared to better resist S. aureus colonization compared to collagen, and silver alone paradoxically seemed to promote biofilm formation, possibly due to an inoculum effect. The very initial phase of S. aureus adhesion to the surface of different vascular grafts was evaluated using atomic force microscopy, and the results are currently under analysis.