Développement d’une méthode électrochimique pour la mesure de l’état rédox des quinones à différents niveaux d’intégration cellulaire chez la levure Saccharomyces cerevisiae

Development of an electrochemical method for the quinone redox state measurement at different levels of cellular integration in the yeast Saccharomyces cerevisiae

• Auteur / Autrice : Mélanie Martins Pinto
• Direction : Stéphane Arbault, Anne Devin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie et Technologies pour le vivant
• Date : Soutenance le 11/12/2024
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des sciences chimiques (Talence, Gironde ; 1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (Bordeaux ; 2007-....)
• Jury : Président / Présidente : Frédéric Lemaitre
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Bertrand Beauvoit
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Petra Hellwig, Fabien Pierrel

Mots clés

Mots clés contrôlés

Métabolisme énergétique

Saccharomyces cerevisiae

Quinone

Électrochimie

Mots clés libres

Électrochimie

Quinone

État rédox

Levure

Métabolisme énergétique

Electrochemistry

Quinone

Redox state

Yeast

Energetic metabolism

Résumé

Le métabolisme énergétique cellulaire regroupe toutes les voies métaboliques de conversion de l’énergie des sources carbonées disponibles dans l’environnement cellulaire en énergie, sous forme d’ATP, indispensable pour assurer les fonctions cellulaires. Dans les cellules aérobies, les mitochondries assurent le couplage de la réoxydation de molécules réduites à la synthèse de la majorité de l’ATP cellulaire par le biais du système des oxydations phosphorylantes (OXPHOS), les plaçant au coeur du métabolisme énergétique cellulaire. Le potentiel rédox cellulaire (défini par le rapport NADH/NAD+) est donc un paramètre important pour le métabolisme cellulaire puisqu’il régule les réactions d’oxydo-réductions liées à la production d’ATP ainsi que l’homéostasie cellulaire vis-à-vis du stress oxydatif. Il est cependant difficile à déterminer, de par sa double compartimentation (cytosolique et mitochondrial) et du fait que la majorité du NADH cellulaire est liée aux enzymes. Les quinones sont des molécules lipophiles présentes dans la membrane interne mitochondriale (Q6 chez Saccharomyces cerevisiae), qui initient le transfert des électrons de molécules réduites (i.e. NADH) en début de la chaîne respiratoire des OXPHOS : des déshydrogénases jusqu’au complexe III. Leur état rédox va dépendre de la capacité de la chaîne respiratoire à réoxyder les substrats disponibles dans la cellule et, de manière plus générale, du fonctionnement des OXPHOS. L’objectif de ces travaux était de développer une technique de mesure électrochimique permettant le suivi en temps réel du taux de réduction des quinones à l’aide d’un médiateur rédox, le coenzyme Q2, associée à celle de la respiration mitochondriale. Nous avons développé cette technique chez la levure S. cerevisiae à trois niveaux d’intégration : la mitochondrie isolée, le sphéroplaste perméabilisé et le sphéroplaste intact. Nos résultats sur mitochondries isolées sont les premiers à montrer clairement que l’état rédox des quinones est un marqueur du métabolisme mitochondrial, influencé par le substrat respiratoire, l’état bioénergétique mitochondrial et par le fonctionnement du cycle de Krebs. Nos études sur sphéroplastes ont montré une régulation distincte en présence d’un environnement cytosolique, reliant métabolisme cellulaire et état rédox des quinones, apportant ainsi une compréhension supplémentaire sur la régulation des OXPHOS et de l’influence du métabolisme cellulaire sur le métabolisme mitochondrial.

Cellular energy metabolism refers to all metabolic pathways that convert energy from available carbon sources in the cellular environment into ATP, which is essential for cellular functions. In aerobic cells, mitochondria couple the reoxidation of reduced molecules to the synthesis of most cellular ATP through the oxidative phosphorylation system (OXPHOS), placing them at the core of cellular energy metabolism. The cellular redox potential (defined by the NADH/NAD+ ratio) is thus a crucial parameter for cellular metabolism, as it regulates redox reactions related to ATP production and cellular homeostasis against oxidative stress. However, it is challenging to determine this redox potential due to its double compartmentalization (cytosolic and mitochondrial) and the fact that most cellular NADH is enzyme-bound. Quinones are lipophilic molecules present in the inner mitochondrial membrane (Q6 in Saccharomyces cerevisiae) that initiate electron transfer at the start of the OXPHOS respiratory chain, from dehydrogenases to Complex III. Their redox state depends on the respiratory chain's ability to reoxidize substrates available in the cell and, more generally, on OXPHOS functioning. This study aimed to develop an electrochemical measurement technique to monitor the real-time reduction rate of quinones using a redox mediator, coenzyme Q2, in combination with mitochondrial respiration monitoring. We developed this technique in S. cerevisiae at three levels of integration: isolated mitochondria, permeabilized spheroplasts, and intact spheroplasts. Our results in isolated mitochondria were the first to clearly demonstrate that the redox state of quinones is as a marker of mitochondrial metabolism, influenced by respiratory substrate, mitochondrial bioenergetic state, and Krebs cycle function. Our studies in spheroplasts showed a distinct regulation in the presence of a cytosolic environment, linking cellular metabolism and quinone redox state, thus providing additional insight into OXPHOS regulation and the influence of cellular metabolism on mitochondrial metabolism.