Modélisation en levure et conséquences fonctionnelles de mutations de l'ADN mitochondrial associées à des pathologies.

Yeast modeling and functional consequences of mitochondrial DNA mutations associated with pathologies

• Auteur / Autrice : Camille Charles
• Direction : Déborah Tribouillard-tanvier
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Inscription en doctorat le 01/09/2021
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Biochimie et Génétique Cellulaires
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Mitochondria & Therapeutics

Mots clés

Mots clés libres

Maladies mitochondriales

Transformation génétique mitochondriale

Levure

ATP synthase

ADN mitochondrial

ATP synthase

Yeast

Mitochondrial diseases

Mitochondrial transformation

Mitochondrial DNA

Résumé

Contexte D'origine endosymbiotique, la mitochondrie est un organite propre aux eucaryotes. Une de ses fonctions bien connue est la production d'adénosine triphosphate (l'ATP), soit la principale source d'énergie cellulaire, via le processus dit des oxydations phosphorylantes (OXPHOS). Dans ce processus, typiquement quatre complexes (I-IV), formant un ensemble appelé la chaîne respiratoire, transfèrent à l'oxygène des électrons libérés par l'oxydation de carbohydrates et d'acides gras. Cette activité est couplée à la formation d'un gradient électrochimique de protons de part et d'autre de la membrane mitochondriale interne, lequel est utilisé par l'ATP synthase (Complexe V) pour générer de l'ATP à partir d'ADP et de phosphate inorganique. Quelques-unes (13 chez l'homme) des 90 protéines formant ces complexes sont encodées par une petite molécule d'ADN localisée dans la mitochondrie (ADNmt) présente en de nombreux exemplaires (jusqu'à plusieurs milliers dans une seule cellule); les autres ont une origine nucléaire. Du fait de son rôle dans la production d'ATP, des défauts dans le fonctionnement ou la formation du système OXPHOS entraînent des maladies (dites mitochondriales) affectant préférentiellement les tissus et organes très énergivores comme les muscles et le cerveau. Malgré sa petite taille, ces pathologies résultent relativement souvent de mutations de l'ADNmt (20% des cas). Chaque année, de nouvelles mutations de cet ADN sont identifiées chez des patients. Leur pathogénicité est souvent difficile à évaluer, en particulier lorsqu'elles coexistent avec des molécules d'ADNmt de type sauvage (cette hétérogénité génétique est appelée hétéroplasmie). De plus, l'ADNmt est relativement polymorphique à cause des dommages causés par les dérivés toxiques de l'oxygène produits dans la mitochondrie et la faible efficacité des systèmes de réparation de cet ADN. Une autre difficulté est l'inexistence de méthodes permettant de modifier l'ADN mitochondrial humain. Il est ainsi difficile pour le médecin d'évaluer la pathogénicité d'un nouveau variant de l'ADNmt et d'en connaître avec précision les conséquences fonctionnelles. La levure Saccharromyces cerevisiae est un modèle particulièrement utile permettant de s'affranchir de ces difficultés. Sa bonne capacité fermentaire lui permet de survivre à des mutations inactivant le système énergétique mitochondrial. Ses mitochondries sont très similaires à celles de l'homme. Il est possible de modifier à loisir son génome mitochondrial (à l'aide d'un système balistique), et l'hétéroplasmie est instable chez cet organisme. Il est ainsi possible de modéliser en levure des mutations de l'ADNmt humain dans un état homoplasmique, et ainsi de savoir comment elles affectent le système OXPHOS. Objectif Dans un premier temps, nous modéliserons en levure cinq mutations du gène mitochondrial ATP6 identifiées récemment chez des patients présentant des atteintes caractéristiques d'une maladie mitochondriale. Le gène ATP6 encode une sous-unité de l'ATP synthase (la sous-unité a). Cette enzyme est constituée de deux grands domaines, appelés FO et F1. Le premier transporte des protons de part et d'autre de la membrane mitochondriale interne ; le second synthétise l'ATP à partir d'ADP et de phosphate inorganique. La sous-unité a fait partie du FO et est essentielle à son activité de transport de protons. Dans un second temps, nous caractériserons l'impact des mutations sur l'ATP synthase de levure. Les mutations chosies pour cette étude affectent des résidus d'acide aminé de la sous-unité a ayant été fortement conservés au cours de l'évolution. Il est de ce fait attendu que la croissance des levures mutantes soit fortement ralentie lorsqu'elles sont dans l'obligation d'utiliser des subtrats (comme le glyécrol) dont le métablisme réquiert des mitochondries fonctionnelles. Dans ce cas, nous rechercherons des suppresseurs intragéniques, ç-à-d des secondes mutations dans le gène ATP6 permettant d'améliorer cette croissance et donc le fonctionnement et/ou la stabilité de l'ATP synthase. Il sera ainsi possible, à la lumière de structures à haute résolution du complexe ATP synthase, de mieux comprendre les bases moléculaires des maladies provoquées par les mutations étudiées.

Context Mitochondria is an organelle found in eukaryotes. One of its well-known functions is the production of adenosine triphosphate (ATP), the main source of cellular energy, via the process of oxidative phosphorylation (OXPHOS). In this process, typically four complexes (I-IV), called the respiratory chain, transfer electrons released by the oxidation of carbohydrates and fatty acids to oxygen. This activity is coupled with the formation of an electrochemical gradient of protons on either side of the inner mitochondrial membrane, which is used by ATP synthase (Complex V) to generate ATP from ADP and of inorganic phosphate. Some (13 in humans) of the 90 proteins forming these complexes are encoded by a small DNA molecule located in the mitochondria (mtDNA) present in numerous copies (up to several thousand in a single cell); the others have a nuclear origin. Because of its role in the production of ATP, defects in the functioning or formation of the OXPHOS system lead to diseases (called mitochondrial diseases) preferentially affecting tissues and organs with high energy-demands such as muscles and brain. Despite its small size, these conditions are relatively often the result of mutations in mtDNA (20% of cases). Each year, new mutations of this DNA are identified in patients. Their pathogenicity is often difficult to assess, especially when they coexist with wild-type mtDNA molecules (this genetic heterogeneity is called heteroplasmy). In addition, mtDNA is relatively polymorphic due to the damage caused by toxic oxygen derivatives produced in the mitochondria and the low efficiency of the repair systems for this DNA. Another difficulty is the lack of methods for modifying human mitochondrial DNA. This makes it difficult for physicians to assess the pathogenicity of a new mtDNA variant and to know precisely its functional consequences. The yeast Saccharromyces cerevisiae is a particularly useful model for overcoming these difficulties. Its good fermentation capacity allows it to survive mutations inactivating the mitochondrial energetic system. Its mitochondria are very similar to those of humans. Its mitochondrial genome can be changed at will (using a ballistic system), and heteroplasmy is unstable in this organism. It is thus possible to model mutations in human mtDNA in a homoplasmic state in yeast, and thus to know how they affect the OXPHOS system. Goal First, we will model in yeast five mutations of the mitochondrial ATP6 gene recently identified in patients with mitochondrial disease. The ATP6 gene encodes an ATP synthase subunit (the a subunit). This enzyme is made up of two large domains, called FO and F1. The first transports protons across the inner mitochondrial membrane; the second synthesizes ATP from ADP and inorganic phosphate. The subunit has been part of the FO and is essential for its proton transport activity. In a second step, we will characterize the impact of mutations on yeast ATP synthase. The mutations chosen for this study affect amino acid residues of the a subunit that have been highly conserved during evolution. It is therefore expected that the growth of mutant yeasts will be greatly slowed down when they are forced to use substrates (such as glyecrol) whose metablism requires functional mitochondria. In this case, we will be looking for intragenic suppressors, i.e. second mutations in the ATP6 gene to improve this growth and therefore the functioning and / or the stability of ATP synthase. It will thus be possible, in the light of high-resolution structures of the ATP synthase complex, to better understand the molecular bases of the diseases caused by the mutations.