Albinisme oculocutané : de l'identification de nouveaux variants pathogènes à la caractérisation des mécanismes physiopathologiques

Oculocutaneous albinism: from identification of new pathogenic variants to characterisation of pathophysiological mechanisms

• Auteur / Autrice : Elina Mercier
• Direction : Sophie Javerzat
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Génétique
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2022
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Lacombe
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Maladies Génétiques du développement

Mots clés

Mots clés libres

Génétique fonctionnelle

Modèles cellulaires

Albinisme

Modèles animaux

Rétinogenèse

Mécanismes moléculaires

Albinism

Retinogenesis

Molecular mecanisms

Cellular models

Animal models

Functional genetics

Résumé

L'albinisme est une maladie rare cliniquement et génétiquement hétérogène, associant hypopigmentation et déficience visuelle sévère.Les liens entre altération de la pigmentation dans l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) et anomalies du développement de la rétine conduisant au déficit visuel demeurent incompris. Ainsi, le 1er objectif de ma thèse est d'élucider ces liens moléculaires entre mélanogénèse et développement rétinien. Ce projet se concentre majoritairement sur 3 types d'albinisme oculocutané et les gènes correspondants : OCA1 (TYR), OCA3 (TYRP1) ainsi qu'OCA8 (DCT). La tyrosinase (TYR) est l'enzyme clé de la mélanogenèse puisqu'elle réalise les premières étapes et notamment la production de L-Dopa. DCT et TYRP1 agissent en aval de la tyrosinase. A ce jour la L-Dopa est fortement pressentie pour être un facteur déterminant dans le développement de la rétine comme cela a été démontré chez la souris modèle d'OCA1. Objectif 1 : Elucider le lien moléculaire entre mélanogénèse et développement rétinien en menant une exploration fonctionnelle sur différents modèles déjà disponibles (mélanocytes en culture, lignées de souris transgéniques). Pour chacun de ces modèles, chaque phénotype est évalué en comparaison au contrôle sauvage ainsi qu'à la perte de fonction de la tyrosinase (OCA1). Les intermédiaires de la voie de mélanogenèse sont dosés par HPLC. L'EPR et la rétine neurale des souris sont explorés par microscopie électronique, par coupes histologiques et par protéomique. Des tests visuels sont en cours de réalisation. Les résultats sont interprétés en prenant en compte les données cliniques des patients affectés dans les gènes correspondants. L'analyse des séquences des 21 gènes connus permet d'atteindre environ 70% de diagnostic. Chez les 30% de cas non résolus, on identifie un nombre significatif de variants rares de signification inconnue (VSI) (par ex : variants introniques, variants synonymes). Le 2nd objectif de ma thèse est de tester la pathogénicité de ces variants par des approches de génétique fonctionnelle. Objectif 2 : Amélioration du diagnostic moléculaire par test fonctionnel de variants rares de signification inconnue et identification des séquences régulatrices du saut de l'exon 10 d'OCA2. En utilisant une approche de test par minigène, nous avons démontré que certains variants dans et autour de l'exon 10 du gène OCA2 pouvaient augmenter le saut de cet exon, jusqu'à le rendre pathogène par effet hypomorphe (Michaud, V., Sequeira, A., Mercier, E., et. al. (2023). Unsuspected consequences of synonymous and missense variants in OCA2 can be detected in blood cell RNA samples of patients with albinism.). Cette étude a mis en évidence que, chez l'humain, le contrôle de la rétention de cet exon est imparfait et très sensible au changement de certains nucléotides. Ainsi en complément des tests de nouveaux VSI dans ce système, nous avons souhaité identifier les nucléotides critiques pour le contrôle du saut de l'exon 10. Pour cela nous nous sommes basés sur le fait que chez les rongeurs comme la souris, la rétention de l'exon 10 est totale. Au cours l'évolution il semblerait en effet que le gène OCA2 humain a évolué sous l'influence d'une pression de sélection (optimisation des codons, stabilité/fonction de la protéine) au détriment du contrôle de la rétention de l'exon 10. Ainsi différentes combinaisons de séquences humaines/murines introniques et exoniques en minigène sont testés en se focalisant sur quelques nucléotides que l'on peut supposer critiques, notamment ceux impliqués dans un changement d'acide aminé entre les deux espèces. Des tests complémentaires de tRSA-RNA pull down et de minigène avec oligoARN antisens sont prévus afin de révéler des mécanismes/régions jusque-là inconnus impliqués dans la régulation de l'épissage de l'exon 10 d'OCA2.

Albinism is a rare clinically and genetically heterogeneous disease, combining hypopigmentation and severe visual impairment. The links between altered pigmentation in the retinal pigment epithelium (RPE) and abnormalities in retinal development leading to visual deficits remain poorly understood. The 1st objective of my thesis is therefore to elucidate these molecular links between melanogenesis and retinal development. This project will focus mainly on 3 types of oculocutaneous albinism and the corresponding genes: OCA1 (TYR), OCA3 (TYRP1) and OCA8 (DCT). Tyrosinase (TYR) is the key enzyme in melanogenesis, since it carries out the initial stages, in particular the production of L-Dopa. DCT and TYRP1 act downstream of tyrosinase. L-Dopa is currently strongly suspected of being a determining factor in retinal development, as demonstrated in the OCA1 mouse model. Objective 1: Elucidate the molecular link between melanogenesis and retinal development by carrying out functional exploration on different models already available (melanocytes in culture, transgenic mouse lines). For each of these models, each phenotype is assessed in comparison with the wild-type control and with the loss of function of tyrosinase (OCA1). Intermediates of the melanogenesis pathway are assessed by HPLC. The RPE and neural retina of mice are explored by electron microscopy, histology and proteomics. Visual tests are being carried out. The results are interpreted taking into account the clinical data of patients affected in the corresponding genes. The analysis of the sequences of the 21 known genes leads to a diagnosis of around 70%. In the 30% of unsolved cases, we identify a significant number of rare variants of unknown significance (VUS) (e.g. intronic variants, synonymous variants). The 2nd objective of my thesis is to assess the pathogenicity of these variants using functional genetic approaches. Objective 2: Improvement of molecular diagnosis by functional testing of rare variants of unknown significance and identification of the regulatory sequences of the OCA2 exon 10 skipping. Using a minigene test approach, we have demonstrated that some variants in and around exon 10 of OCA2 gene can increase the skipping of this exon, to the point of making it pathogenic by hypomorphic effect (Michaud, V., Sequeira, A., Mercier, E., et. al. (2023). Unsuspected consequences of synonymous and missense variants in OCA2 can be detected in blood cell RNA samples of patients with albinism). This study showed that, in humans, the control of retention of this exon is imperfect and highly sensitive to changes of some nucleotides. In addition to testing new VUS in this system, we wanted to identify the nucleotides that are critical for controlling exon 10 skipping. We based our work on the fact that in rodents such as mice, exon 10 retention is complete. Over the course of evolution, it would appear that the human OCA2 gene has evolved under the influence of selection pressure (codon optimisation, protein stability/function) to the detriment of exon 10 retention control. Different combinations of human/murine intronic and exonic sequences in minigene are tested, focusing on a few nucleotides that are presumably critical, in particular those involved in an amino acid change between the two species. Complementary tRSA-RNA pull-down and minigene tests with antisense oligoRNA are planned in order to reveal mechanisms / regions so far unknown involved in the regulation of splicing of exon 10 of OCA2.