Caractéristiques de nouvelles mutations dans le gene de l'intégrase et dans le 3'PPT du virus de l'Immunodéficience Humaine dans le mécanisme de résistance

Characteristics of new mutations in the integrase gene and in the 3'PPT of the Human Immunodeficiency Virus in the resistance mechanism

• Auteur / Autrice : Nhat Quang Tu
• Direction : Olivier Delelis, Clémence Richetta
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 18/09/2025
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : LBPA - Laboratoire de Biologie et Pharmacologie Appliquée
• Partenaire(s) de recherche : Référent : École normale supérieure Paris-Saclay (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 1912-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Alessia Zamborlini
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Matteo Negroni, Sarah Gallois-montbrun, Marc Lavigne
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Matteo Negroni, Sarah Gallois-montbrun

Mots clés

Mots clés libres

Mutation

Hiv-1

Integration

Résistance

Mutation

Hiv-1

Integration

Resistance

Résumé

Le VIH-1, membre de la famille des Retroviridae, est l'agent étiologique du SIDA — l'une des pandémies les plus dévastatrices et persistantes de l'histoire contemporaine. Malgré les avancées majeures dans la thérapie antirétrovirale (TAR), les traitements actuels reposent principalement sur les inhibiteurs de l'intégrase (INSTIs), ciblant spécifiquement l'étape d'intégration du génome viral. Toutefois, l'émergence de variants du VIH-1 résistants aux INSTIs constitue un défi urgent pour les stratégies de santé publique. Ce travail de recherche développe et valide une méthode innovante de quantification de l'ADN intégré du VIH-1, en affinant la technique classique Alu-PCR. Cette nouvelle approche combine des amorces Alu biotinylées, une séparation magnétique via des billes M280 recouvertes de streptavidine, et un traitement enzymatique ciblant l'ADN simple brin par les exonucléases RecJf et ExoVII. Ce protocole améliore significativement la spécificité en éliminant les signaux non spécifiques provenant de l'ADN viral non intégré, réduisant les faux positifs de plus de 2,5 log₁₀, et détecte l'ADN intégré dans 10 % des échantillons cliniques auparavant classés comme négatifs par la méthode traditionnelle. Au-delà de l'innovation méthodologique, ce travail met en évidence deux mécanismes atypiques de résistance aux INSTIs. Le premier concerne des mutations d'insertion dans le gène codant pour l'intégrase, introduisant des acides aminés supplémentaires qui abolissent totalement l'activité enzymatique, rendant le virus insensible aux traitements ciblant l'intégrase via une perte fonctionnelle de la cible moléculaire. Le second mécanisme repose sur des mutations au niveau du segment polypurine 3′ (3′PPT), une séquence ARN conservée essentielle à la synthèse de l'ADN brin positif pendant la transcription inverse. Ces mutations perturbent le rôle initiateur du 3′PPT, bloquant l'intégration du génome viral, mais favorisent la formation d'ADN viral circulaire non intégré (cercles 1-LTR). Les expériences démontrent que les souches mutantes du VIH-1 portant des altérations du 3′PPT ne forment pas de provirus intégré, mais continuent néanmoins à exprimer des protéines virales (Tat, GFP) à partir de l'ADN circulaire. Certaines de ces souches peuvent même se répliquer et produire des particules virales infectieuses sans passage par l'intégration, révélant un nouveau mode de réplication indépendant de l'intégration. Notamment, la formation de ces cercles 1-LTR a lieu dans le cytoplasme, contrairement aux souches de type sauvage qui les produisent dans le noyau, suggérant une stratégie adaptative permettant au virus de contourner l'action des INSTIs. En somme, cette étude contribue à améliorer les outils de quantification du VIH intégré tout en révélant des mécanismes de résistance non conventionnels. Elle remet en question le dogme selon lequel l'intégration est indispensable à la réplication productive du VIH-1, et souligne la nécessité de surveiller de manière plus large les mutations non classiques dans le cadre du traitement moderne du VIH.

HIV-1, a member of the Retroviridae family, is the etiological agent of AIDS—one of the most devastating and persistent pandemics in modern human history. Despite significant advances in antiretroviral therapy (ART), current treatment regimens predominantly rely on integrase strand transfer inhibitors (INSTIs), which target the viral integration step. However, the emergence of drug-resistant HIV-1 variants, particularly those that evade integration-targeted therapies, presents an urgent challenge to global health efforts. This thesis addresses this gap by developing and validating a novel, highly sensitive quantitative method for measuring integrated HIV-1 DNA. Building upon the conventional Alu-PCR assay, the new approach employs biotinylated Alu primers in combination with M280 streptavidin-coated magnetic bead separation and enzymatic degradation of single-stranded DNA using RecJf and ExoVII exonucleases. This refined method significantly improves specificity by removing non-specific signals arising from unintegrated viral DNA, achieving a signal reduction exceeding 2.5 log₁₀, and successfully identifying integrated DNA in 10% of clinical samples (2 out of 20) that were falsely negative by the traditional technique. Beyond methodological innovation, this research uncovers two unconventional resistance mechanisms to INSTIs. First, insertional mutations within the integrase gene, characterized by the addition of extra amino acids, lead to a complete loss of integrase function. This renders the virus impervious to INSTIs through a “target-null” mechanism—distinct from point mutations—wherein the drug's molecular target is structurally or functionally eliminated. Second, and more strikingly, are mutations within the 3′ polypurine tract (3′PPT), a conserved RNA sequence essential for initiating plus-strand DNA synthesis during reverse transcription. These mutations disrupt the integrity of the 3′PPT, effectively halting the integration process. Yet, paradoxically, they enable the virus to persist and even replicate through the accumulation and expression of unintegrated viral DNA, particularly in the form of 1-LTR circular episomes. Experimental findings reveal that HIV-1 strains harboring 3′PPT mutations, such as ΔPPT and PPT→A variants, fail to produce integrated proviruses yet retain the ability to express viral proteins, including Tat and GFP, from non-integrated circular DNA. Some mutants are even capable of assembling and releasing infectious viral particles, indicating the existence of a novel integration-independent replication pathway. Notably, 1-LTR circles in these mutant viruses form in the cytoplasm, in contrast to wild-type HIV-1, which generates these episomes exclusively within the nucleus. This cytoplasmic formation bypasses traditional nuclear processing and suggests an adaptive mechanism by which HIV-1 can evade the effects of INSTIs. Collectively, this work not only advances HIV-1 diagnostic methodology but also redefines our understanding of viral plasticity under pharmacological pressure. The demonstration of replication-competent, non-integrated forms of HIV-1 challenges the long-standing paradigm that integration is strictly required for productive infection. These findings underscore the importance of expanding surveillance to include non-canonical resistance mechanisms and support the urgent need for therapeutic strategies capable of targeting both integrated and unintegrated forms of HIV-1.