Étude fonctionnelle d'un nouveau système d'acquisition du cuivre chez Bordetella pertussis

Functional study of a new copper acquisition system in Bordetella pertussis

• Auteur / Autrice : Majda Hachmi
• Direction : Francoise Jacob-dubuisson
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé - MED
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2022
• Etablissement(s) : Université de Lille (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre d'Infection et d'Immunité de Lille
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Recherche sur les Mycobactéries et les Bordetelles

Mots clés

Mots clés libres

Bordetella pertussis

Cuivre

Respiration

Cytochrome oxydase

Acquisition

Transporteur TonB dépendent

Bordetella pertussis

Copper

Respiration

Cytochrome oxidase

Acquisition

TonB dependent transporter

Résumé

À la fois essentiels et toxiques, les métaux de transition jouent un rôle important à l'interface entre les bactéries pathogènes et leurs hôtes, et les deux partenaires régulent finement l'homéostasie de ces éléments. Ce projet vise à étudier le mécanisme par lequel Bordetella pertussis, l'agent de la coqueluche, assure son approvisionnement en cuivre, un métal indispensable à la survie de cette bactérie, mais très peu biodisponible. L'opéron bfrG-bp2921 est dans un locus dédié à l'homéostasie du cuivre et forme un nouveau système d'acquisition du cuivre. L'inactivation de ces gènes affecte la croissance de B. pertussis en conditions d'oxygénation limitante, suggérant que ce système fournit du cuivre à une des cytochrome-oxydases terminales chez ce microorganisme aérobie strict. Les deux protéines seront produites et purifiées sous forme recombinante. Leur capacité à fixer le cuivre sous forme libre ou complexé à des chélateurs du Cu intracellulaires sera analysée par des techniques biophysiques dans le cadre de collaborations. Des modèles de structure des deux protéines, obtenus avec Alphafold2, serviront à identifier des sites de fixation potentiels pour les mutagéniser. Les mutations seront introduites dans les protéines recombinantes ainsi que dans le génome de la bactérie par échange allélique, afin de déterminer les effets in vitro et les phénotypes in vivo des mutants. Les interactions entre les deux protéines seront étudiées pour comprendre la voie d'entrée du cuivre dans les cellules. Ces expériences permettront de déterminer comment et sous quelle forme le métal est capté et transporté. Pour définir le(s) système(s) au(x)quel(s) le cuivre est fourni, les transcriptomes de B. pertussis seront comparés par RNA sequencing en conditions de cultures statiques (moindre oxygénation) et de cultures agitées (forte oxygénation) pour les souches sauvage et mutante pour cet opéron, afin d'identifier les gènes régulés de façon différentielle pour s'adapter à ces conditions. Les gènes candidats seront inactivés dans les souches sauvage et mutante et les phénotypes de ces mutants seront analysés. Des expériences de colonisation du tractus respiratoire de souris seront effectuées pour déterminer le rôle de cet opéron dans la pathogénie. Ces travaux permettront d'élucider un nouveau mécanisme impliqué dans l'apport en cuivre chez une bactérie pathogène. Le métabolisme bactérien fait partie intégrante de la pathogénicité, et ainsi la compréhension des mécanismes mis en jeu peut à terme déboucher sur de nouvelles stratégies de lutte contre les infections. Le système de B. pertussis servira aussi de modèle pour des systèmes homologues trouvés chez de nombreuses autres bactéries.

Transition metals are both essential and toxic, and they play an important role at the host-pathogen interface. Both the host and the pathogen tightly control its homeostasis. The goal of this project is to study the mechanism by which Bordetella pertussis, the whooping cough agent, ensures the acquisition of copper, a metal essential for its survival but very little bio-available. The bp2921-bfrG operon is in a locus dedicated to copper homestasis, and it forms a new system for import and utilization of copper. Inactivation of these genes affects the growth of B. pertussis under oxygen-limiting conditions, suggesting that this system provides copper to one of the cytochrome oxidases of this strictly aerobic bacterium. The two proteins will be produced and purified in recombinant form. Their capacity to bind free copper or copper in the form of complexes with intracellular chelators (such as glutathione or small copper chaperones) will be analyzed by biophysical techniques, in collaboration with experts. Structural models of the two proteins that we have generated with AlphaFold2 will be used to identify potential copper binding sites, which will be mutagenized. The mutations will be re-introduced in the bacterial genome to study the phenotypes of the mutants, and in the recombinant proteins to determine their effects on Cu binding in vitro. Interactions of two proteins will be studied to decipher the entry path of copper in the bacteria. These experiments will determine under which form and how the metal is captured and transported. To define the cuproproteins to which the system under study provides copper, the transcriptomes of B. pertussis will be analyzed by RNA sequencing under conditions of static (low oxygenation) or agitated (high oxygenation) growth for the wild type and mutant strains, to identify the genes that are differentially regulated under the two sets of conditions. These genes will be inactivated in the wild type and mutant strains, and the phenotypes of the mutants will be determined. Experiments of mouse colonization will be performed with the wild type and mutant strains to determine the role of this operon in B. pertussis pathogeny. This work will decipher a new mechanism involved in the provision of copper to a pathogenic bacterium. Bacterial metabolism is an integral component of pathogenicity, and therefore the understanding of the mechanisms that are at play might lead to the identification of new strategies to fight bacterial infections. As homologous systems are present in many bacteria, the original system studied in this program will also serve as a model.