Etude de la reconnaissance du LPS par les récepteurs immunitaires lectine de type C dans un environnement imitant la surface cellulaire

Investigation of LPS recognition by immunity C-type lectin receptors in a cell-surface mimicking environment

• Auteur / Autrice : Massilia Abbas
• Direction : Cedric Laguri
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Structurale et Nanobiologie
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 09/09/2024
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Biologie Structurale
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Groupe de RMN biomoleculaires
• Jury : Président / Présidente : Olivier Renaudet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Cedric Laguri, Alba Silipo, Latifa Elantak, Julie Bouckaert
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Alba Silipo, Latifa Elantak

Mots clés

Mots clés libres

Lps

Lectine de type C

Spectroscopie RMN

Nanodisques

Biologie structurale intégrative

Lps

C-type lectins

NMR spectroscopy

Nanodiscs

Integrative structural biology

Résumé

L'enveloppe des bactéries Gram-négatives est décoré de LipoPolySaccharides (LPS) qui représentent le principal composant glycolipidique de sa surface. Les LPSs sont constitués de trois parties principales : le lipide A, lié à une chaîne Oligo-Saccharidique (OS), qui elle-même est liée à une partie polysaccharidique O-antigène. En raison de leur densité et de leur variabilité structurelle, les LPS sont des éléments clés de la résistance aux antimicrobiens et de la virulence. En tant que composants exposés en surface, ils sont considérés étant activateurs du système immunitaire des plantes, des animaux et des humains. La partie lipide A est détectée par le système immunitaire soit de manière extracellulaire par la cascade TLR4, soit de manière intracellulaire par le système des caspases. En revanche, leur partie glycane est reconnue par les récepteurs de lectine de type C (CLR) présents sur les cellules présentatrices d'antigènes (APC). Il s'agit d'une famille de protéines à laquelle des rôles clés ont été attribués dans la défense et l'homéostasie de l'hôte. Dans cette étude, nous avons étudié les interactions entre la lectine MGL de type galactose des macrophages humains et les glycanes de surface d'E. coli. Nous avons démontré la capacité de la MGL à se lier à l'OS R1 d'E. coli par des approches intégratives allant du niveau cellulaire au niveau atomique. La microscopie à fluorescence et la cytométrie en flux ont premièrement révélé la forte capacité du MGL à lier les surfaces d'E. coli de type R1, tandis que SPR a fourni une estimation de l'affinité de cette interaction. Néanmoins, il a été constaté que cette interaction se produisait indépendamment du site canonique de liaison des glycanes dépendant du calcium. La spectroscopie RMN a été utilisée pour identifier un nouveau site de liaison des glucides sur la surface opposée au site d'interaction canonique dans le domaine de reconnaissance des glucides (CRD) de MGL. Un modèle de la MGL trimérique a été construit en combinant la diffusion des rayons X aux petits angles et la modélisation AlphaFold. Ce modèle a montré l'arrangement 3D particulier des CRD de la MGL présentant jusqu'à six sites de liaison de glycanes (2 par CRD) favorisant ainsi la liaison des LPS à la surface de la bactérie avec une affinité accrue. L'interaction de la MGL avec les glycanes bactériens a été étudié dans un modèle imitant la surface cellulaire en utilisant des LPS reconstitués en nanodisque avec du copolymère d'acide styrène-maléique. À cette fin, un protocole de préparation de nanodisques de LPS provenant de diverses souches, allant de souches de laboratoire à des souches pathogènes d'E. coli, a été établi. Ce protocole a été appliqué avec succès à des LPS purifiés et à des LPS extraits de membranes externes. Les modèles membranaires mimétiques obtenus ont été étudiés et se sont révélés compatibles avec plusieurs méthodes biophysiques ; leur distribution de taille et leur épaisseur ont été évaluées par microscopie à force atomique. Les différents composants des membranes externes bactériennes ont pu être observés à l'échelle atomique par RMN du solide. Les nanodisques LPS ont également été utilisés avec succès pour étudier les interactions avec la lectine de type C de l'immunité MGL par QCM-D et BLI, et seront maintenant utilisés pour construire un modèle détaillé décrivant l'arrangement de l'ECD de la MGL sur les nanodisques de LPS de membrane.

The envelope of Gram-negative bacteria is decorated with LipoPolySaccharides (LPSs) representing the main glycolipid component of its surface. LPSs are constituted of three main parts: lipid A linked to an OligoSaccharide chain (OS), which in turn is linked to an O-antigen polysaccharide portion. Given their dense packing and structural variability, LPSs are key elements in antimicrobial resistance and virulence. As surface exposed components, they are potent activators of the immune system of plants, animals, and humans. Their lipid A moiety is detected by the immune system either extracellularly by the TLR4 cascade or intracellularly by the caspase system. Whereas, their glycan part is found to be recognized by C-type Lectin Receptors (CLRs) present on Antigen Presenting Cells (APC). A protein family to which key roles have been attributed in host defence and homeostasis. In this study, we investigated the interactions involving human Macrophage Galactose-type Lectin MGL and E. coli surface glycans. We demonstrated the ability of MGL to bind E. coli R1 core OS by integrative approaches spanning from the cellular to the atomic level. Fluorescence microscopy and flow cytometry primarily revealed the strong ability of MGL to bind E. coli R1 type core surfaces, while SPR provided an estimation of the interaction affinity. Nevertheless, this interaction was found to occur regardless of the canonical calcium-dependent glycan binding site. NMR spectroscopy was used to identify a novel carbohydrate binding site on opposite surface of the canonical interaction site within MGL Carbohydrate Recognition Domain (CRD). A model of the trimeric MGL was built using a combination of small-angle X-ray scattering (SAXS) and AlphaFold modelling. This model showed the convenient 3D arrangement of MGL CRDs presenting up to six accessible glycan binding sites (2 per CRD) favourable to bind LPSs at the bacterial surface with enhanced affinity. MGL interaction with bacterial glycans was further monitored in a cell surface mimicking model using Styrene-Maleic Acid (SMA) copolymer LPS nanodiscs. To that end, a protocol for the preparation of LPS nanodiscs originating from various strains ranging from laboratory to pathogenic E. coli strains was established. This protocol was successfully applied on purified LPS and LPS extracted from outer membranes. The resulting membrane-mimetic models were studied and proved suitable for several biophysical methods; their size distribution and thickness were assessed by Atomic Force Microscopy. The different components of bacterial outer membranes could be observed at atomic scale by solid-state NMR. LPS nanodiscs were also successfully used to monitor interactions with MGL immunity C-type lectin by Quartz Crystal Microbalance with Dissipation monitoring (QCM-D) and BioLayer Interferometry (BLI), and now will be used to build a model depicting the arrangement of MGL ECD on LPS membrane nanodiscs.