Nouvelles approches in vitro pour étudier l'impact des variants pathologiques de NR2F1 dans des cellules humaines

New in vitro approach to study the NR2F1 pathological variants impact in human cells

• Auteur / Autrice : Paul Cassini
• Direction : Michèle Studer, Chakrabandhu Krittalak
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Interactions Moléculaires et Cellulaires
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2022
• Etablissement(s) : Université Côte d'Azur
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : INSTITUT DE BIOLOGIE VALROSE
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Development and function of brain circuits

Mots clés

Mots clés libres

Neurobiologie

Biologie Cellulaire

Biologie Moléculaire

Cellules Souches

Pathologie

Neurobiology

Cell Biology

Molecular Biology

Stem cells

Pathology

Résumé

Le syndrome d'atrophie optique de Bosch-Boonstra-Schaaf (BBSOAS) est un trouble du neurodéveloppement humain entrainant une déficience intellectuelle, de l'autisme, et une atrophie du nerf optique. Ce syndrome est causé par les mutation d'un seul gène, NR2F1, un régulateur transcriptionnel important dans le développement du cerveau. Le projet de thèse s'inscrit dans les études du laboratoire visant à comprendre l'impact des différentes mutations du gène identifiées chez les patients sur la protéine NR2F1 et son rôle dans le développement du cerveau. Pour ce faire, l'étudiant utilisera l'Expansion de Code Génétique (GCE), une technique de biologie de synthèse de pointe, dans des progéniteurs neuraux, dans des neurones matures et dans des organoïdes cérébraux obtenus à partir de cellulessouches pluripotentes humaines (hiPSC). Tout d'abord, l'étudiant générera des lignées stables de cellules souches 2D humaines GCE portant des composants d'expansion du code génétique et ciblera le gène NR2F1 modifié avec des mutations de patients et un codon stop « ambre » pour l'incorporation spécifique d'acides aminés non canoniques permettant le contrôle temporel de l'expression de la protéine, de la visualiser dans les cellules en culture ou bien d'identifier ses partenaires protéiques par photo-réticulation. Ces approches seront appliquées après avoir différencié les hiPSCs en progéniteurs neuraux ou en neurones matures. Ces lignées stables permettront également d'étudier l'impact des mutations du gène NR2F1 sur la prolifération, l'apoptose et la différenciation des cellules neurales. Dans un second temps, Ces lignées stables seront utilisées dans des cultures 3D d'organoïdes cérébraux, un modèle permettant de reproduire fidèlement les premières étapes du développement du cerveau. L'étudiant y étudiera à nouveau l'impact des mutations pathologiques du gène NR2F1 sur la prolifération et la différentiation des cellules neurales, mais également leur effet sur la mise en place de tissus comme les épithéliums neuraux.

The project is a part of our interdisciplinary studies of a neurodevelopmental disorder called Bosch-Boonstra-Schaaf optic atrophy (BBSOAS) syndrome, which is characterized by intellectual disability, autism, epilepsy and optic nerve atrophy. BBSOAS is caused by mutations in the gene NR2F1, a key transcriptional regulator during brain development. In this PhD project, the student will apply an in vitro approach based on the Genetic Code Expansion (GCE), a state-of-the-art synthetic biology technology, to investigate the consequences of NR2F1 mutations in the differentiative ability and in the identification of co-factors in human neuronal stem cells. Using this novel protein engineering technology, which is based on chemical biology, the student will precisely dissect the genotype-phenotype correlation and predict the effect of different mutations identified in patients. First, the student will generate stable GCE human 2D stem cell lines bearing genetic code expansion components and target amber-codon modified NR2F1 gene for site- specific incorporation of photocrosslinking and clickable unnatural amino acids (UAAs). This approach will then be transferred into 3D human organoid cultures bearing distinct NR2F1 mutations and differentiated into cortical progenitors and neurons. In a second time, the student will characterize the genetic code-expanded human stem cell lines and NR2F1 mutant organoids based on the UAA incorporation efficiency, GCEd-NR2F1 expression and function, rate between proliferation and differentiation, and cell morphology and behavior. The project takes advantage of a multidisciplinary approach using state-of the-art molecular biology, human stem cell biology, GCE, click chemistry, cell cloning, 3D organoid cultures, site-directed mutagenesis, flow cytometry and high-resolution microscopy.