Microscopie électronique 3D multi-échelle pour l'analyse de l'architecture du foie

Multiscale 3D electron microscopy to decipher Liver Architecture

• Auteur / Autrice : Cécile Pohar
• Direction : Aurélien Deniaud
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Structurale et Nanobiologie
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2022
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Chimie et Biologie des Métaux

Mots clés

Mots clés libres

Sinusoïdes

Cellules Stellaires

Microscopie électronique 3D

Ultrastructure du foie

Morphogenèse du foie

Sinusoid

Stellate cells

3D electron microscopy

Liver morphogenesis

Liver ultrastructure

Résumé

Le foie est un organe majeur du métabolisme qui possède une architecture très complexe. Le foie est organisé en lobules hexagonaux avec la veine hépatique au centre. Le sang provenant de la veine porte et de l'artère hépatique à la périphérie du lobule se mélange dans des capillaires hépatiques très spécifiques, appelés sinusoïdes. Le sang s'écoule ensuite hors du lobule par la veine hépatique. Les hépatocytes sont disposés en cordons hépatiques séparés par des sinusoïdes adjacents. En outre, à l'intérieur de chaque cordon et entre les surfaces apicales des hépatocytes adjacents, des canalicules biliaires sont formées et constituent un réseau de canaux de taille micrométrique. Les hépatocytes présentent donc un phénotype de polarité unique, obtenu grâce à des mécanismes de différenciation finement orchestrés qui restent jusqu'à présent énigmatiques. Ces dernières années, nous avons développé l'utilisation de la microscopie électronique 3D (3D-EM) pour l'étude des échantillons biologiques. La 3D-EM révolutionne l'imagerie ultrastructurale dans de nombreux domaines de la biologie. Elle comprend un ensemble de techniques où un échantillon est coupé tranche par tranche par différents moyens, et chaque nouvelle surface est imagée en série. Dans le SBF-SEM, la surface de l'échantillon est enlevée par un ultramicrotome, ce qui permet un accès robuste à de grands volumes mais avec une résolution limitée, tandis que le FIB-SEM utilise un canon à gallium pour enlever la surface de l'échantillon, ce qui permet d'atteindre une résolution de l'ordre du nanomètre. Dans le cadre de l'architecture du foie, nous voulons profiter de l'utilisation combinée des deux techniques, pour explorer l'architecture hépatique à différentes échelles et dans différents contextes afin de répondre à des questions biologiques clés. Le premier objectif abordé sera d'obtenir l'architecture du foie de souris adultes saines, depuis une vue macroscopique de la corde hépatique jusqu'à la reconstruction des détails de régions clés telles que l'espace de Disse ou les canalicules biliaires. Le deuxième objectif sera d'approfondir la morphogenèse du foie de souris grâce à l'analyse de foie de souris à différents stades de développement. Enfin, le troisième objectif sera d'explorer le rôle des protéines morphogénétiques osseuses, BMP9 et BMP10, dans la différenciation de l'endothélium hépatique grâce à l'analyse de foie de souris. Globalement, la méthodologie développée dans ce projet fournit une approche originale pour explorer l'ultrastructure du tissu au niveau cellulaire. La doctorante se concentrera principalement sur l'acquisition et l'analyse des données ultrastructurales. En parallèle, des discussions avec des experts en biologie du foie et en angiogenèse permettront à la doctorante d'analyser et d'interpréter efficacement les données. Au cours de la première année, la doctorante sera d'abord formée au FIB-SEM et à l'analyse des données. La doctorante recrutée bénéficiera de l'expertise d'un autre doctorant qui met actuellement en place la méthodologie d'analyse du foie. Ensuite, la doctorante mettra en place le flux d'acquisition de données couplé SBF-SEM / FIB-SEM grâce à un échange avec notre collaborateur de l'Université de Lausanne. Enfin, la doctorante obtiendra et analysera les données de différents foies de souris afin de répondre à des questions clés sur le développement du foie. La doctorante devra donc réaliser la reconstruction 3D, la segmentation, et enfin l'analyse biologique avec l'aide d'experts en biologie du foie.

The liver is a major organ for metabolism that possesses a very complex architecture. The liver is organized in hexagonal lobules with the hepatic vein at the center. Blood from both the portal vein and the hepatic artery at the periphery of the lobule mix together in very specific liver capillaries, named sinusoids. Blood then drains out of the lobule through the hepatic vein. Hepatocytes are arranged in hepatic cords separated by adjacent sinusoids. Besides, within each cord and between apical surfaces of adjacent hepatocytes, bile canaliculi are formed and constitute a network of micrometer-sized channels. Hepatocytes thus exhibit a unique polarity phenotype that is obtained thanks to finely orchestrated differentiation mechanisms that remain puzzling up to now. In the last years, we have developed the use of 3D electron microscopy (3D-EM) for the study of biological samples. 3D-EM is revolutionizing ultrastructural imaging in many fields of biology. It comprises a set of techniques where a sample is cut slice by slice by different means, and each new surface is imaged in series. In SBF-SEM, sample surface is removed by an ultramicrotome, which allows robust access to large volumes but with a limited resolution, while FIB-SEM uses a gallium gun to remove sample surface enabling to reach nanometer range resolution. In Liver-Architecture, we want to take advantage of the combined use of both techniques, to explore hepatic architecture at different scales and in different contexts to answer key biological questions. The first objective tackled will be to obtain healthy adult mice liver architecture from a macroscopic view of the hepatic cord down to the reconstruction of the details of key regions such that the Disse space or bile canaliculi. The second objective will be to delve mice liver morphogenesis thanks to the analysis of liver from mice at different developmental stages. Finally, the third objective will be to explore the role of bone morphogenetic proteins, BMP9 and BMP10, in liver endothelium differentiation thanks to liver from knock out mice. Overall, the methodology developed in this project provides an original approach to explore ultrastructure from tissue to cell level. The PhD student will mainly focus on ultrastructural data acquisition and analysis. In parallel, discussions with experts in liver biology and angiogenesis will provide the support for the PhD student to efficiently perform data analysis and interpretation. During the first year, the PhD student will firstly be trained to FIB-SEM and data analysis. The recruited PhD student will benefit from the expertise of another PhD student currently setting-up the methodology for liver analysis. Then, the PhD student will implement the coupled SBF-SEM / FIB-SEM data acquisition workflow thanks to exchange with our collaborator at the University of Lausanne. Finally, the PhD student will acquire and analyze data from different mice liver to answer key questions about liver development. The PhD student will thus have to perform 3D reconstruction, segmentation, and finally biological analysis with the help of experts in liver biology.