Immunoglobulines G de patients sclérodermiques : optimisation des méthodes de purification, étude de la glycosylation et analyse de l'impact sur le profil protéomique de fibroblastes

Immunoglobulin G from systemic sclerosis patients : optimization of purification techniques, study of glycosylation, and analysis of its effect on the proteomic profile of fibroblasts

• Auteur / Autrice : Louisa Bourel
• Direction : Vincent Sobanski
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie moléculaire
• Date : Soutenance le 14/10/2024
• Etablissement(s) : Université de Lille (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institute for Translational Research in Inflammation (Lille)
• Jury : Président / Présidente : Sylvain Dubucquoi
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Marie-Élise Truchetet, Julia Chamot-Rooke

Mots clés

Mots clés contrôlés

Spectrométrie de masse en tandem

Chromatographie en phase liquide à haute performance

Protéome

Fibroblastes

Glycosylation

isolement et purification

Immunoglobuline G

Anticorps antinucléaires

Sclérodermie systémique

Spectrométrie de masse avec ionisation électrospray

Chromatographie en phase liquide à hautes performances

Protéome

Fibroblastes

Glycosylation

Purification

Immunoglobuline G

Anticorps antinucléaires

Sclérodermie généralisée

Mots clés libres

Sclérodermie systémique

Immunoglobuline G

Glycosylation

Fibroblaste

ANA

Purification IgG

Systemic sclerosis

Immunoglobulin G

Glycosylation

Fibroblast

ANA

IgG purification

Résumé

La sclérodermie systémique (SSc) est une maladie rare auto-immune caractérisée par une vasculopathie, une fibrose extensive de la peau et des organes internes, ainsi qu’une dysimmunité se manifestant par la présence d’auto-anticorps. D’étiologie inconnue et avec des présentations cliniques très hétérogènes, le diagnostic et la prise en charge de la SSc demeurent complexes. La présence d’anticorps anti-nucléaires (ANA) est un marqueur diagnostique et pronostique clé de la SSc. Certaines spécificités d’ANA, comme les anticorps anti-topoisomérase I, sont corrélées à des atteintes d’organes plus sévères. Cependant, le rôle précis des ANA dans la pathogenèse de la maladie reste à élucider. Les objectifs de cette thèse étaient de comparer différentes méthodes de purification d’immunoglobulines G (IgG) de patients SSc et d’étudier leur glycosylation puis d’analyser leurs effets potentiels sur le fibroblaste (FB), acteur majeur de la fibrose.En premier lieu, une comparaison de plusieurs méthodes de purification des IgG a été entreprise en se focalisant sur le rendement, la pureté et la qualité des IgG obtenues. Les méthodes testées incluaient la chromatographie d’affinité, la chromatographie échangeuse d’ions ainsi que des méthodes de précipitation. Bien que des différences aient été observées en termes de rendement et de pureté des échantillons purifiés, toutes les techniques employées ont permis de maintenir la qualité des IgG. En particulier, la préservation des IgG spécifiques et de leur avidité a été assurée, garantissant ainsi la validité des études suivantes.Ensuite, une étude de la glycosylation des IgG a été réalisée. Cette modification post-traductionnelle est essentielle à la fonction des IgG en influençant leur conformation et leur reconnaissance par les cellules immunitaires. Une analyse glycoprotéomique a été effectuée sur des IgG polyclonales purifiées provenant de patients SSc et présentant différentes spécificités d’auto-anticorps : anti-centromères, anti-topoisomérase I ou anti-ARN polymérase III. Les comparaisons entre les profils de glycosylation des IgG de patients SSc et de sujets sains ont révélé des différences significatives, les patients SSc présentant une prédominance de glycoformes pro-inflammatoires.La dernière partie de ce travail de thèse a été consacrée à l’optimisation d’un modèle cellulaire permettant l’étude de l’effet des IgG sur le profil protéomique de FB. Les FB jouent un rôle crucial dans la pathogenèse de la SSc en contribuant à la production excessive de matrice extracellulaire, responsable de la fibrose. Le protéome de FB dermiques sains a été analysé par LC-MS/MS afin d’examiner les effets des IgG de patients SSc sur ces cellules. Nos expériences ont souligné l’importance des paramètres de culture cellulaire, notamment l’utilisation de sérum de voeu foetal, qui pourrait activer les cellules, ainsi que la variabilité intrinsèque des FB dermiques sains en fonction de facteurs tels que l’âge du donneur et la localisation de prélèvement. Ces paramètres contribuent à la diversité protéomique et à la réactivité des cellules à une stimulation externe.Les travaux présentés dans cette thèse ont permis de comparer plusieurs méthodes de purification des IgG, assurant ainsi leur qualité pour les expériences in vitro. L’analyse de la glycosylation des IgG a révélé que les patients SSc présentaient une prédominance de glycoformes pro-inflammatoires, soulignant la potentielle pathogénicité des anticorps. Les études protéomiques des FB dermiques ont mis en évidence l’importance des paramètres de culture cellulaire. Ces résultats fournissent de nouvelles perspectives sur les pratiques de culture pour la mise en place de modèles cellulaires.

Systemic sclerosis (SSc) is a rare autoimmune disease characterized by vasculopathy, extensive skin and internal organ fibrosis, and dysimmunity manifested by the presence of autoantibodies. The diagnosis and management of SSc remain complex because of its unknown etiology and highly heterogeneous clinical presentations. The presence of anti-nuclear antibodies (ANA) is a crucial diagnostic and prognostic indicator of SSc. Specific ANA specificities, such as anti-topoisomerase I antibodies, have been associated with more severe organ involvement. Despite this, the precise role of ANA in the disease pathogenesis remains unclear. The aims of this thesis were to compare different immunoglobulin G (IgG) purification techniques, to study the IgG glycosylation of SSc patients, and analyze their potential effects on fibroblasts (FB), which are essential in the fibrosis process.Initially, a comparison of various IgG purification techniques was conducted to determine their effectiveness in terms of yield, purity, and quality of IgG obtained. The methods assessed comprised affinity chromatography, ion-exchange chromatography, and precipitation. Although disparities were observed in the yield and purity of the purified samples, all techniques employed maintained the quality of IgG. More specifically, the preservation of specific IgG and their avidity was ensured, thereby guaranteeing the validity of subsequent investigations.Then, IgG glycosylation was explored. This post-translational modification is essential for IgG function, as it influences its conformation and recognition by immune cells. Glycoproteomic analysis was conducted on purified polyclonal IgG from SSc patients with different autoantibody specificities: anti-centromere, anti-topoisomerase I, or anti-RNA polymerase III. Comparisons between the IgG glycosylation profiles of SSc patients and healthy subjects revealed significant differences, with SSc patients exhibiting a predominance of pro-inflammatory glycoforms.The final part of this thesis focused on optimizing a cell model allowing the study of SSc patients IgG effects on the proteomic profile of FB. FB plays a crucial role in SSc pathogenesis by contributing to excessive extracellular matrix production, which is responsible for fibrosis. The proteome of healthy dermal FB was analyzed using LC-MS/MS to examine the effects of IgG from SSc patients on these cells. Our experiments have emphasized the significance of cell culture parameters, including the use of fetal bovine serum, which may activate cells, and the intrinsic variability of healthy dermal FB based on factors such as age of the donor and sampling location. These parameters contribute to proteomic diversity and responsiveness of cells to external stimuli.This thesis presents an examination of multiple IgG purification methods for their suitability in in vitro experiments. The analysis of IgG glycosylation revealed that SSc patients exhibit a predominance of pro-inflammatory glycoforms, which underscores the potential pathogenicity of antibodies. Proteomic studies on dermal FB have highlighted the importance of cell culture parameters. These findings offer new insights into cell culture practices for the implementation of cell models.