Etude du potentiel biopesticide des lipopeptides, des polykétides et de la bacilysine dans la lutte contre la maladie de la galle du collet

Study of the biopesticide potential of lipopeptides, polyketides and bacilysin in the fight against crown gall disease

• Auteur / Autrice : Sarra Yousfi
• Direction : François Coutte, Olfa Frikha-Gargouri
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 06/06/2024
• Etablissement(s) : Université de Lille (2022-....) en cotutelle avec Université de Sfax (Tunisie)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la matière, du rayonnement et de l'environnement (Lille ; 1992-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : UMR Transfrontalière BioEcoAgro
• Jury : Président / Présidente : Lotfi Feki
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Essaïd Ait Barka, François Krier
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Balkiss Bouhaouala-Zahar, Anissa Lounès-Hadj Sahraoui

Mots clés

Mots clés contrôlés

Antagonistes

Agrobacterium tumefaciens

Lutte contre

Bactéries phytopathogènes

Lipopeptides

Biopesticides

Mots clés libres

Biopesticide

Lipopeptides

Polykétides

Bacilysine

Galle du collet

Bacillus velezensis

Biopesticide

Lipopeptides

Polyketides

Bacilysin

Crown gall

Résumé

La maladie de la galle du collet, causée par Agrobacterium tumefaciens, représente une menace majeure pour les fruits à noyau, en particulier dans les pays méditerranéens. Dans une étude précédente, la souche 32a de Bacillus velezensis a été isolée et identifiée comme étant une souche efficace contre les souches phytopathogènes d'A.tumefaciens. La compréhension de l'implication des métabolites spécifiques issus des souches microbiennes est essentielle pour le développement de nouveaux produits de biocontrôle basés sur ces microorganismes. Dans ce contexte, l'objectif de ce travail de thèse a été d'investiguer spécifiquement les composés actifs de B.velezensis 32a impliqués dans l'antagonisme contre ce pathogène. Pour atteindre cet objectif, une approche intégrée combinant des analyses biochimiques, des techniques moléculaires. Une fois caractérisées, la cytotoxicologie de ces composés a été investiguée.La caractérisation du surnageant de culture par chromatographie liquide à haute performance en phase inverse couplée à la spectrométrie de masse (RP-HPLC-MS) a révélé la capacité de la souche 32a à synthétiser diverses isoformes de lipopeptides, de polykétides, de la bacilysine et son dérivé chloré, la chlorotétaine. L'étude de l'implication spécifique des lipopeptides purs dans l'antagonisme contre A.tumefaciens a été réalisée selon la méthode de diffusion à partir d'un puits et la méthode de microdilution en série. Les résultats ont montré que ces molécules ne présentaient pas d'activité antagoniste. Ensuite, des souches mutantes de trois polykétides et de la bacilysine ont été générées par génie génétique et l'évaluation de leur activité antagoniste a indiqué le rôle crucial de la difficidine dans la suppression d'A.tumefaciens. Une étude plus approfondie comparant les mutants de la souche 32a avec 17 mutants d'une souche similaire de B.velezensis GA1 a confirmé la contribution significative de la difficidine et a souligné son effet synergique avec la macrolactine. De même, les résultats ont montré que le mutant déficient en bacillibactine a considérablement réduit l'activité antibactérienne, suggérant ainsi sa capacité à inhiber la croissance d'A.tumefaciens. Enfin, afin d'étudier la synergie de ces molécules anti-A.tumefaciens et leur cytotoxicité une purification de ces composés a été réalisée par HPLC préparative. L'évaluation du pouvoir antagoniste des fractions purifiées a confirmé l'effet synergique entre la macrolactine A et l'oxydifficidine, ainsi que l'implication significative de la bacillibactine dans l'antagonisme contre A.tumefaciens. La partie portant sur la cytotoxicité qui restent à confirmer montrent une très faible cytotoxicité de ces molécules ou de leurs mélanges avec des IC50 supérieures à 500 mg/L.

Crown gall disease, caused by Agrobacterium tumefaciens, poses a major threat to stone fruits, especially in Mediterranean countries. In a previous study, strain 32a of Bacillus velezensis was isolated and identified as an effective strain against phytopathogenic strains of Agrobacterium. Understanding the involvement of specific metabolites derived from microbial strains is essential for the development of new biocontrol products based on these microorganisms. In this context, the objective of this thesis work was to specifically investigate the active compounds of B.velezensis involved in antagonism against this pathogen. To achieve this goal, an integrated approach combining biochemical analyses and molecular techniques was used. Once characterized, the cytotoxicity of these compounds was investigated. Characterization of the culture supernatant by high-performance reverse-phase liquid chromatography coupled with mass spectrometry (RP-HPLC-MS) revealed the ability of 32a strain to synthesize various isoforms of lipopeptides, polyketides, bacilysin, and its chlorinated derivative, chlorotetaine. The study of the specific involvement of pure lipopeptides in antagonism against A.tumefaciens was conducted using well diffusion and serial microdilution methods. The results showed that these molecules did not exhibit antagonistic activity. Subsequently, mutant strains of three polyketides and bacilysin were generated through genetic engineering, and evaluation of their antagonistic activity indicated the crucial role of difficidin in suppressing A.tumefaciens. An in-depth study comparing 32a mutants with 17 mutants of a similar B.velezensis GA1 strain confirmed the significant contribution of difficidin and highlighted its synergistic effect with macrolactin. Similarly, the results showed that the bacillibactin-deficient mutant significantly reduced antibacterial activity, suggesting its ability to inhibit the growth of A.tumefaciens. Finally, to study the synergy of these anti-A.tumefaciens molecules and their cytotoxicity, purification of these compounds was performed by preparative HPLC. Evaluation of the antagonistic power of the purified fractions confirmed the synergistic effect between macrolactin A and oxydifficidin, as well as the significant involvement of bacillibactin in A.tumefaciens antagonism. The part regarding the cytotoxicity wich remains to be further investigated indicate a very low cytotoxicity of these molecules, with an IC50 value exceeding 500 mg/L.