Interaction entre les lymphocytes B et la peau au cours de la sclérodermie systémique

Interaction between B-cells and Skin in Systemic Sclerosis

• Auteur / Autrice : Mathilde Le maitre
• Direction : David Launay
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé - MED
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2020
• Etablissement(s) : Université de Lille (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Lille ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Recherche Translationnelle sur l'Inflammation

Mots clés

Mots clés libres

Sclérodermie systémique

Fibrose

Lymphocyte B

Peau

Systemic sclerosis

Fibrosis

B cell

Skin

Résumé

La sclérodermie systémique (ScS) est associée à des perturbations de l'homéostasie et des fonctions des cellules du système immunitaire. Parmi celles-ci, les lymphocytes B (LB) semblent jouer un rôle important dans la physiopathologie de la maladie. Au-delà de la production d'auto-anticorps, les LB infiltrent la peau et les organes des patients ainsi que des modèles expérimentaux de ScS, présentent des modifications phénotypiques et fonctionnelles, et interagissent directement et indirectement avec les fibroblastes (Fb), cellules principalement responsables de la fibrose tissulaire dans la ScS. Ces interactions LB/Fb ont essentiellement été étudiées dans des cocultures en deux dimensions mais les données restent peu nombreuses et l'impact de ces cocultures sur les LB reste inconnu. Afin d'explorer plus précisément ces interactions bidirectionnelles LB/Fb, nous avons mis au point un modèle de coculture entre des LB issus de patients sclérodermiques ou de sujets sains et un modèle tridimensionnel (3D) de peau saine reconstituée comprenant fibroblastes, kératinocytes et matrice extra-cellulaire (MEC), permettant une modélisation plus physiologique que la 2D. L'infiltration des LB dans la peau a été caractérisée par microscopie confocale et cytométrie. L'effet de cocultures en 2D et 3D a ensuite été exploré par une approche sans a priori de transcriptomique globale. Un focus particulier a été fait sur la coculture de peau 3D avec des LB activés de patients sclérodermiques à travers l'utilisation de la transcriptomique sur cellule unique (single-cell RNA sequencing). Enfin, des cytokines spécifiques ayant un rôle important dans la ScS (IL-6, TNF-α, TNF-β, Galectine 3) ont été inhibées en cocultures 2D afin d'explorer les mécanismes moléculaires de l'interaction LB/Fb. Nous avons observé une infiltration de la peau par des LB provenant de sujets sains ou de patients ScS dans le modèle de coculture 3D. L'intensité de l'infiltration était plus importante quand les LB étaient activés et provenaient de patients ScS, alors que la profondeur d'infiltration était identique quelles que soient les conditions. L'infiltrat LB était essentiellement composé de LB naïfs et mémoires, dont les ratios variaient en fonction de l'origine et de l'état d'activation des LB. Par rapport aux LB circulants avant coculture, les LB de patients ScS ayant infiltré la peau en 3D présentaient un état d'activation et de maturation orienté vers la production d'anticorps. Nous avons ensuite montré que les LB activés en coculture avec les fibroblastes modifiaient le profil transcriptomique à la fois des fibroblastes sains et de patients ScS, vers un profil pro-inflammatoire et lié à l'interféron, avec un rôle clé de la voie du TNF. Ces travaux de thèse ont donc montré que l'interaction LB/Fb est modélisable en 2D et en 3D, que les profils transcriptomiques des LB ScS et des fibroblastes deviennent pro-inflammatoires après coculture et que l'implication de la voie du TNF dans ce modèle est centrale.

Systemic sclerosis (SSc) is associated with alterations in the homeostasis and functions of immune cells. Among them, B-cells seem to have an important role in the disease's pathophysiology. Beyond autoantibody production, B-cells infiltrate the skin of SSc patients and animal models, display phenotypic and functional discrepancies, and interact directly and indirectly with fibroblasts, the main cell type responsible for tissue fibrosis in SSc. These B-cells/fibroblasts interactions have been mainly analyzed in two-dimensional cocultures, but data is scarce and the impact on B-cells remains unknown. To explore more precisely these bidirectional interactions between B-cells and fibroblasts, we developed a coculture model between B-cells from patients with SSc or healthy donors, and a three-dimensional healthy reconstituted skin model including fibroblasts, keratinocytes and extra-cellular matrix, providing a more physiological modelization of the skin than 2D cell culture. B-cell infiltration in the skin models was characterized using confocal microscopy and cytometry. The consequences of 2D and 3D coculture on the cells were then studied with a global transcriptomic strategy. A point of focus was made on coculture between 3D skin and activated SSc B-cells via single-cell RNA sequencing. Finally, specific cytokines important for SSc (IL-6, TNF-α, TNF-β, Galectin 3) were inhibited in 2D cocultures, in order to explore the molecular mechanisms of B-cell/fibroblast interaction. We showed a significant infiltration of B-cells in the 3D healthy skin model. The amount but not the depth of infiltration was higher with B-cells from SSc patients and with activated B-cells. B-cell infiltrates were mainly composed of naïve and memory cells, whose frequencies differed depending on B-cells origin and activation state: infiltrated B-cells from patients with SSc showed an activated profile and a maturation process towards antibody-producing cells compared to circulating B-cells before infiltration. Our study has shown for the first time that activated B-cells modified the transcriptomic profile of both healthy and SSc fibroblasts, towards a pro-inflammatory (TNF and IL-17 signaling) and interferon profile, with a key role of the TNF pathway. Overall, this work demonstrated that B-cells/fibroblasts interactions are reproducible in vitro in 2D and 3D settings. The transcriptomic profiles of both SSc B-cells and fibroblasts become pro-inflammatory after coculture, and TNF signaling has a crucial involvement in this model.