Proposition d'une Thérapie Photodynamique ciblant FRα pour le traitement des métastases microscopiques des cancers épithéliaux de l'ovaire : Evaluation préclinique de son efficacité anti-tumorale et de ses propriétés adjuvantes immunostimulantes

Proposal of a Photodynamic Therapy targeting FRα for the treatment of microscopic metastases of epithelial ovarian cancers: Preclinical evaluation of its anti-tumor efficacy and immunostimulatory adjuvant properties

• Auteur / Autrice : Léa Boidin
• Direction : Nadira Delhem
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé - MED
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2021
• Etablissement(s) : Université de Lille (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Thérapies Assistées par Lasers et Immunothérapies pour l'Oncologie
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : IMMUNO-PDT

Mots clés

Mots clés libres

Cancer de l'ovaire

Thérapie photodynamique

Récepteur aux folates

Thérapie ciblée

Mort cellulaire immunogène

Ovarian cancer

Photodynamic therapy

Folate receptor

Targeted therapy

Immunogenic cell death

Résumé

Le cancer de l'ovaire est le 7ème cancer le plus fréquent chez la femme. Souvent découvert à un stade avancé, il évolue rapidement en carcinose péritonéale ovarienne correspondant à l'envahissement de la cavité péritonéale par de multiples nodules tumoraux. La thérapie standard repose sur une chirurgie de cytoréduction associée à une chimiothérapie. Cependant, 70% des femmes en rémission font une rechute. L'amélioration du traitement du cancer de l'ovaire nécessite donc des voies de recherche ayant pour objectif le contrôle de la maladie péritonéale microscopique infra- radiologique qui est ignorée lors de la chirurgie macroscopique. La thérapie photodynamique qui s'appuie sur l'utilisation de l'O2, d'un médicament photosensibilisateur (PS) et d'une lumière de longueur d'onde spécifique du PS, est déjà indiquée dans les lésions superficielles de surface étendue et pourrait donc s'avérer être stratégie thérapeutique pertinente dans la carcinose péritonéale ovarienne. De plus, la PDT est également capable de stimuler nos défenses immunitaires comme le font les immunothérapies actuelles. En effet, certains de ces effets sont similaires à l'immunothérapie puisque la PDT permet la mise en place d'une réponse immunitaire dirigée contre la tumeur. Quelques essais cliniques ont pu démontrer la faisabilité d'un traitement par PDT dans la carcinose péritonéale. Cependant, la mauvaise tolérance du traitement et l'absence de réponse complète ont conduit à s'interroger sur la spécificité des PS utilisés. Le récepteur au folate de type ⍺ (FR⍺), qui est surexprimé dans 80% des cancers ovariens d'origine épithéliale, pourrait faire partie des cibles permettant un adressage spécifique du photosensibilisateur au sein de la tumeur. Ainsi, ces dernières années, dans le cadre de cette potentielle application thérapeutique, le développement de nouveaux PS de 3ème génération a vu le jour. Ces PS ont notamment été couplés à l'acide folique afin de cibler spécifiquement les cellules cancéreuses ovariennes d'origine épithéliale surexprimant FR⍺. Cependant, ces PS une fois testés présentaient (i) une fluorescence modérée empêchant leur détection et (ii) une faible stabilité. Ainsi, il existe encore aujourd'hui un réel besoin d'améliorer ces PS dit de « 3ème génération », afin qu'ils puissent présenter à la fois une bonne efficacité thérapeutique, un ciblage spécifique des métastases péritonéales et une fluorescence suffisante afin de visualiser ces lésions au moyen de dispositifs médicaux (fluoroguidage). Dans ce contexte un nouveau PS couplé à l'acide folique comprenant un motif pyrophéophorbide-a conjugué à l'acide folique via un bras espaceur de type polyéthylène glycol (PSAF ou PS2) a fait l'objet d'un brevet publié en 2017 par l'unité ONCOTHAI et leurs collaborateurs (Dr Céline Frochot, laboratoire Réaction et Génie des Procédés, Nancy). La première étude menée sur un modèle de culture 2D et qui a été publiée a montré que la PDT associée au PS2 pouvait être efficace, non seulement pour détruire directement les cellules tumorales ovariennes, mais aussi pour favoriser l'activation d'une réponse immunitaire effectrice médiée par les vésicules extracellulaires. De plus, l'étude de son efficacité in vivo sur un modèle murin humanisé de carcinose péritonéale ovarienne a montré qu'un traitement par PDT-PS2 induisait un arrêt de la croissance tumorale. L'activation d'une réponse immunitaire via l'induction de cytokines anti-tumorales et l'augmentation de lymphocytes anti-tumoraux, ainsi qu'une inhibition de cytokines pro-inflammatoires et pro-tumorales ont également été décrites. Les objectifs de ma thèse de Sciences s'inscrivent dans la perspective de la mise en place d'un essai clinique de phase I évaluant la PDT-PS2. Dans ce contexte, il semblait pertinent (i) d'étudier de manière plus approfondie la sélectivité de cette thérapie, (ii) d'évaluer le potentiel de la PDT à induire une mort cellulaire immunogène et (iii) de développer de nouveaux PS couplés à l'acide folique et présentant une meilleure stabilité que le PS2. Ainsi, l'étude de la sélectivité du traitement et de son efficacité seule ou en combinaison dans différents modèles cellulaires feront l'objet de la 1ère partie de ma thèse et seront évaluées en termes: (i) d'étude de l'incorporation sélective du PS2 au sein des lignées qui surexpriment FR⍺ contrairement à une lignée contrôle, (ii) d'étude de son affinité pour le FR⍺ (Kd), (iii) de capacité de la PDT utilisant le PS2 à induire de manière préférentielle la mort de cellules surexprimant FR⍺, (iv) d'analyse de l'impact de la PDT sur le microenvironnement inflammatoire du cancer de l'ovaire et enfin (v) d'évaluation de d'efficacité de la PDT-PS2 seule ou en combinaison avec des inhibiteurs de PARP sur un modèle de « tumoroïdes » issus de cellules tumorales de patientes. La capacité de cette PDT ciblée à induire une mort immunogène feront l'objet de la 2ème partie de ma thèse et seront évaluées en terme, (i) de caractérisation des mécanismes de mort induits par ce traitement (apoptose, nécrose…); (ii) de capacité de la PDT-PS2 à induire la libération de signaux de dangers (DAMPs) propices à cette mort cellulaire immunogène. En outre, le PS2 étant actuellement en cours de synthèse aux normes de Bonnes Pratiques de Fabrication afin de pouvoir l'utiliser en clinique, la 3ème partie de ma thèse sera dédiée à la validation in vitro et in vivo de l'efficacité de ce lot GMP en la comparant au PS2 originel. Et enfin, il a été démontrée que la molécule d'acide folique pouvait manquer de stabilité dans certaines conditions. Par conséquent sur la base d'études de docking moléculaire, un analogue d'acide folique ayant une affinité potentiellement élevée pour FR⍺ a été développé par les 2 équipes de chimie avec lesquelles nous collaborons étroitement [Dr Céline FROCHOT : LRGP Université de Lorraine et Dr Samir ACHERAR : LCPM, Université de Nancy]. Ce nouvel analogue (AAF) a ensuite été couplé à un photosensibilisateur (PS), le pyrophéophorbide-a (PSAAF). Ainsi, la 4ème partie de ma thèse consiste à apporter la preuve de concept de l'efficacité biologique de ce nouveau PSAAF dans l'objectif de proposer un PS plus stable que son prédécesseur. Cette preuve de concept sera évaluée en termes : (i) d'étude de l'incorporation sélective du PSAAF au sein des lignées qui surexpriment FR⍺contrairement à une lignée contrôle, (ii) de capacité de la PDT utilisant ce PS à induire de manière préférentielle la mort de cellules surexprimant FR⍺, (iii) d'étude de son affinité pour le FR⍺, (iv) d'impact de la PDT-PSAAF sur le secrétome des cellules cancéreuses et des conséquences sur le système immunitaire. Ainsi, la réalisation de la PDT ciblant FRa dans des lignées cellulaires et des lignées d'organoïdes dérivées de carcinoses ovariennes humaines devraient permettre de mieux appréhender l'efficacité de ce type de traitement dans des modèles cellulaires pertinents mimant l'hétérogénéité d'une masse tumorale. Ces résultats s'ils aboutissent devraient entrouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans un cancer aujourd'hui en impasse thérapeutique.

Ovarian cancer is the 7th most frequent cancer among women, often discovered at an advanced stage, it evolves rapidly in ovarian carcinomatosis peritonel which means invasion of the peritoneal cavity with multiple tumor implants. The current treatment is based on the combination of a tumor cytoreduction surgery and chemotherapy. However, 70% of women in remission relapsed. Improvement of this treatment cancer needs new lines of research, which aim to control de microscopic peritoneal disease ignored during macroscopic surgery. Photodynamic Therapy, which use a combination of oxygen, a photosensitizer and a specific light, has been particularly indicated for the treatment of superficial lesions in dermatology and could be a relevant candidate in response to this therapeutic need. In addition, PDT is also able to stimulate our immune defenses as do current immunotherapies. Indeed, some of these effects are similar to immunotherapy since PDT allows the establishment of an immune response against the tumor. A few clinical trials have demonstrated the feasibility of PDT treatment in peritoneal carcinosis. However, the poor tolerability of the treatment and the lack of a complete response have led to questions about the specificity of the PS used. specificity of the PS used. The ⍺-type folate receptor (FR⍺), which is overexpressed in 80% of ovarian cancers of epithelial origin, could be one of the targets enabling specific addressing of the photosensitizer within the tumor. In recent years, this potential therapeutic application has led to the development of new 3rd-generation PSs. In particular, these PS have been coupled with folic acid to specifically target ovarian cancer cells of epithelial origin overexpressing FR⍺. However, when tested, these PS exhibited (i) moderate fluorescence, preventing detection, and (ii) poor stability. Thus, there is still a real need to improve these so-called ''3rd generation'' PSs, so that they can present both good therapeutic efficacy, specific targeting of peritoneal metastases and sufficient sufficient fluorescence to visualize these lesions using medical devices (fluoroguidance). In this context, a new folic acid-coupled PS comprising a pyropheophorbide-a unit conjugated to folic acid via a polyethylene glycol-type spacer arm (PSAF or PS2) was the subject of a patent published in 2017 by the by the ONCOTHAI unit and their collaborators (Dr Céline Frochot, Laboratoire Réaction et Génie des Procédés, Nancy). The first study carried out on a 2D culture model and published showed that PDT combined with PS2 could be effective not only in directly destroying ovarian tumor cells, but also in promoting the activation of an effector immune response mediated by extracellular vesicles. In addition, the study of its in vivo efficacy in a humanized humanized murine model of ovarian peritoneal carcinosis showed that treatment with PDT-PS2 induced tumor growth arrest. Activation of an immune response via induction of anti-tumor cytokines and increase in anti-tumor lymphocytes, as well as inhibition of pro-inflammatory and pro-tumor cytokines have also been described. The objectives of my Science thesis are to set up a Phase I clinical trial evaluating PDT-PS2. In this context, it seemed pertinent to (i) further investigate the selectivity of this therapy, (ii) evaluate the potential of PDT to induce immunogenic cell death, and (iii) develop new folic acid-coupled PSs more stable than PS2. Thus, the study of treatment selectivity and efficacy alone or in combination in different cell models will be the subject of Part 1 of my thesis and will be evaluated in terms of: (i) study of the selective incorporation of PS2 within lines that overexpress FR⍺ in contrast to a control line, (ii) study of its affinity for FR⍺ (Kd), (iii) ability of PDT using PS2 to preferentially induce the death of cells overexpressing FR⍺, (iv) analysis of the impact of PDT on the inflammatory microenvironment of ovarian cancer, and finally (v) to evaluate the efficacy of PDT-PS2 alone or in combination with PARP inhibitors on a ''tumoroid'' model derived from patient tumor cells. The ability of this targeted PDT to induce immunogenic death will be the subject of Part 2 of my thesis, and will be assessed in terms of (i) characterization of the death mechanisms induced by this treatment (apoptosis, necrosis, etc.); (ii) the ability of PDT-PS2 to induce the release of danger signals (DAMPs). PS2 is currently being synthesized to Good Manufacturing Practice, The 3rd part of my thesis will be dedicated to validating the efficacy of this GMP batch in vitro and in vivo, by comparing it with the original PS2. And finally, it has been shown that the folic acid molecule may lack stability under certain conditions. Consequently, on the basis of molecular docking studies, a folic acid analog with a potentially high affinity for FR⍺ was developed by the 2 chemistry teams with which we collaborate closely [Dr Céline FROCHOT: LRGP Université de Lorraine and Dr Samir ACHERAR: LCPM, Université de Nancy]. This new analog (AAF) was then coupled to a photosensitizer (PS), pyropheophorbide-a (PSAAF). Thus, the 4th part of my thesis consists in providing proof of concept of the biological efficacy of this new PSAAF with the aim of proposing a more stable PS than its predecessor. This proof of concept will be evaluated in terms of terms of: (i) studying the selective incorporation of PSAAF into lines that overexpress FR⍺in contrast to a control line, (ii) the ability of PDT using this PS to preferentially induce the death of cells overexpressing FR⍺, (iii) studying its affinity for FR⍺, (iv) the impact of PDT-PSAAF on the cancer cell secretome and the consequences for the immune system. Thus, the realization of folate receptor targeted PDT in cell lines and organoid lines derived from human ovarian carcinoma should make it possible to better understand the effectiveness of this type of treatment in relevant cell models mimicking the heterogeneity of a mass tumor. These results, if successful, should open up new therapeutic perspectives in a cancer that is currently at a therapeutic stalemate.