Identification de nouveaux déterminants génétiques du retard de croissance

Characterization of the molecular causes of short stature

• Auteur / Autrice : Anne-Sophie Lambert
• Direction : Agnès Linglart, Jérôme Bouligand
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Inscription en doctorat le 31/10/2021
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Signalisations et réseaux intégratifs en biologie
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Physiologie et Physiopathologie Endocriniennes
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Faculté de médecine

Mots clés

Mots clés libres

Petite taille

Croissance

Squelette

Génétique

Short stature

Growth

Genetic variants

Résumé

1. Contexte a. Définition La croissance linéaire est le résultat de la chondrogenèse au niveau des plaques de croissance des os longs et des vertèbres. Par conséquent, toutes les formes de retards de croissance sont dues à une atteinte de la chondrogenèse, tandis que l'accélération de la croissance est une stimulation de la chondrogenèse. L'étude des pathologies monogéniques de la croissance ainsi que des études d'association pangénomiques (GWAS) de la taille adulte indiquent que la croissance est régulée par un réseau de facteurs systémiques et locaux importants pour la chondrogenèse. Actuellement, les enfants atteints de retards de croissance sont évalués pour exclure les troubles nutritionnels, hormonaux (hormone de croissance, IGF-1, hormone thyroïdienne, glucocorticoïdes, stéroïdes sexuels), inflammatoires, autres troubles systémiques, dysplasies squelettiques, et autres syndromes. Le retard statural de l'enfant est la porte d'entrée dans une myriade de pathologies de l'enfant et de l'adolescent. Si, dans la grande majorité des cas, le diagnostic étiologique n'est pas identifié, la priorité pour le médecin est de ne pas méconnaître des pathologies sévères qui nécessitent une prise en charge parfois urgente. La juste mesure dans la conduite des explorations reste difficile à trouver, en l'absence de données prouvées (evidence-based) sur les performances diagnostiques des différentes investigations. Par définition, le retard statural désigne un enfant dont la taille est inférieure à – 2 DS, ce qui concerne statistiquement 2,5 % des enfants si on fait abstraction des problèmes de normes. De même une taille à – 1,5 DS au-dessous de la taille cible (Moyenne des tailles des parents) est considérée comme anormale. L'enquête étiologique élimine en première intention les causes acquises. La priorité diagnostique est de ne pas méconnaître un craniopharyngiome, une mucoviscidose, ou une maladie cœliaque par exemple. Les explorations cytogénétiques (caryotype FISH CGH array) permettent de chercher les causes constitutionnelles connues associées aux retards de croissance (Syndrome de Turner, anomalies cytogénétiques, maladie mitochondriale); les panels de gènes ciblés orientés par l'enquête clinique permettront également au clinicien d'éliminer les diagnostics les plus courants de retard statural (syndrome de Noonan, pseudohypoparathyroïdie, maladie osseuse constitutionnelle, achondroplasie, hypochondroplasie, dyschondrostéose, syndrome de Silver Russel). La caractérisation clinique et endocrinienne des patients est particulièrement importante pour identifier parmi ces patients, ceux qui ont une pathologie de l'axe GH-IGF1 (hypopituitarismes congénitaux). Dans la majorité des cas, aucune cause ne peut être identifiée, et le retard de croissance est dit « idiopathique ». Il s'agit d'un diagnostic d'exclusion, fondé en principe sur l'absence de cause identifiée de petite taille. Ce diagnostic est particulièrement important aux États-Unis, où la petite taille « idiopathique » est une indication reconnue du traitement par l'hormone de croissance. Il représenterait aujourd'hui 70 % des patients explorés pour une petite taille. Il est intéressant de noter que l'étude de la variation de la taille normale en génome entier a identifié un grand nombre des gènes associés aux retards de croissance monogéniques. Cela suggère que de nombreux gènes impliqués dans la croissance contiennent des variants associés à un large éventail de phénotypes allant de troubles de croissance graves tels que les dysplasies osseuses ou le nanisme à à la variation normale de la taille Exploration de l'axe GH-IGF1 Les deux éléments principaux de l'axe somatotrope sont l'hormone de croissance (GH) sécrétée par l'antéhypophyse et l'Insulin-like Growth Factor 1 (IGF 1) sécrété principalement par le foie. La sécrétion d'IGF-1 est considérée comme un bon reflet de la sécrétion de GH, sous réserve de l'absence de trouble de la nutrition (anorexie ou, inversement, excès d'apports caloriques) ou d'une maladie chronique (insuffisance rénale, hépatique, maladies digestives...). La concentration physiologique est également très variable en fonction de l'âge et du stade pubertaire. Ainsi, il est difficile de poser un diagnostic de déficit en GH sur un dosage d'IGF1. La stratégie traditionnelle est donc basée sur des tests dynamiques de stimulation dans un service spécialisé, mais de mauvaise fiabilité et reproductibilité ce qui impose la réalisation d'une IRM de la région hypothalamo-hypophysaire (une anomalie structurelle de l'hypophyse ou une tumeur de la région). b. Déterminants génétiques de la petite taille Il existe dans la littérature un haut degré d'héritabilité de la taille (> 80%) ce qui souligne le rôle prédominant des facteurs génétiques. Les études récentes des déterminants génétiques par association pangénomique montrent que le Retard de taille pourrait être secondaire soit à l'association de variants génétiques (polygénisme) soit à l'anomalie d'un seul gène (monogénisme). Un retard de croissance d'origine génétique peut également être majoré par un trouble nutritionnel associé. Ainsi causes génétique + environemental peuvent coexister. La plupart de ces variants communs et rares concernent des gènes impliqués dans le développement de la plaque de croissance. La plupart des gènes identifiés dans les petites tailles sont déjà connus dans des maladies monogéniques bien décrites (Gènes impliqués dans l'ossification endochondrale ou dans sa régulation gènes de l'axe GH / IGF1). L'examen à posteriori des enfants présentant une petite taille sans diagnostic associée à une anomalie génétique retrouve des anomalies cliniques ou radiologiques chez la plupart d'entre eux ce qui amène à discuter le parcours médical du patient et surtout l'importance de bien les caractériser. Le diagnostic génétique est important afin de comprendre la cause du retard statural, de pouvoir faire bénéficier d'un traitement par hormone de croissance mais également proposer un conseil génétique. Le service d'endocrinologie et diabète de l'enfant de Bicêtre Paris Saclay dispose d'une des plus grandes cohortes de retard de croissance nationales. Nous réalisons quotidiennement des explorations complètes (générale, hormonale, génétique, radiologique) chez des patients avec retard de croissance. Les explorations génétiques actuellement réalisées sont le caryotype (100% des cas), la CGH array, la recherche d'anomalie du gêne SHOX (FISH Caryotype +/- Séquence NGS) et FGFR3 (Séquençage NGS). Nous disposons également d'un panel de gènes NGS calcium (Dr Bouligand, Filière Oscar) comprenant les principaux gènes connus dans les maladies du métabolisme phosphocalcique mais comportant également de nombreux gènes impliqués dans le retard de croissance. Le rendu diagnostic reste cependant faible comme cela est décrit dans la littérature (10 à 12.5 % en fonction des études). Malgré les explorations ciblées décrites ci-dessus (caryotype, CGH, FISH, panels ciblés sur la clinique) un certains nombres de patients et de familles de patients ont des retards de croissance inexpliqués <-2DS familiaux associés à des phénotypes caractéristiques : RCIU, profil de résistance à la GH, profil de déficit en hormone de croissance, anomalie de forme de la plaque de croissance. L'objectif de notre travail est donc d'identifier de nouvelles causes de retards de croissance, de les valider in vitro et de proposer des approches thérapeutiques adaptées . 2. Méthodologie Nous proposons de réaliser ce travail en 3 étapes : a. Approche A Priori i. Implémentation de la base de données • 200 patients sont hospitalisés par an pour bilan de retard de croissance, nous avons déjà identifiés une trentaine de familles sans diagnostic. • Précision de la prévalence des gènes connus (monogénisme ou oligogénisme) et du diagnostic génétique de la petite taille au sein de notre cohorte. • Déclaration de la cohorte au CRB, stockage et requalification des échantillons d'ADN • Constitution du registre de données, demande de CPP ii. Caractérisation des patients : phénotype des patients (taille, poids, vitesse de croissance, état nutritionnel (IMC), différence entre la taille de l'enfant et sa taille cible, anomalie hormonale de l'axe GH-IGF1, données radiologiques (Age Osseux, l'IRM à la recherche d'un syndrome d'interruption de la tige pituitaire, d'une post-hypophyse ectopique ou d'une hypoplasie hypophysaire)). Corrélation phénotype / génotype. iii. Extension du panel gène candidat b. Approche SANS A PRIORI Dans un deuxième temps, nous proposons d'utiliser la technique du whole exome sequencing pour les patients pour lesquels aucun diagnostic n'est retrouvé à la recherche de nouveaux variants (monogénisme ou oligogénisme) c. Approche fonctionnelle Nous envisageons de réaliser en parallèle un Projet de caractérisation fonctionnelle in vitro des nouveaux variants identifiés chez les patients soit par NGS soit par exome. 3. Perspectives Ce projet vise à améliorer le diagnostic du retard de croissance chez l'enfant par l'augmentation du taux de diagnostic des formes monogéniques via l'approche NGS mais aussi l'identification de facteurs polygéniques individuellement pertinents. L'objectif est également de réévaluer les corrélations entre les phénotypes biochimiques/endocriniens et les variants génétiques, et de réévaluer la démarche diagnostique devant un retard de croissance. Les résultats de cette étude permettront d'améliorer la prise en charge de ces patients afin de leur proposer éventuellement un traitement mais aussi un conseil génétique. Il faut savoir qu'un enfant avec un retard de croissance arrive en moyenne en consultation qu'à l'âge de 8 ans et commence un traitement entre 9 et 10 ans ; le retard au diagnostic est majeur. Notre démarche s'inscrit donc dans une meilleure compréhension de la physiologie pour améliorer le parcours du patient. Bibliographie 1. Wood AR, Esko T, Yang J, Vedantam S, Pers TH, Gustafsson S, et al. Defining the role of common variation in the genomic and biological architecture of adult human height. Nat Genet. nov 2014;46(11):1173‑86. 2. Evolutionary conserved networks of human height identify multiple Mendelian causes of short stature | European Journal of Human Genetics [Internet]. [cité 2 sept 2021]. Disponible sur: https://www.nature.com/articles/s41431-019-0362-0 3. Plachy L, Dusatkova P, Maratova K, Petruzelkova L, Elblova L, Kolouskova S, et al. Familial Short Stature—A Novel Phenotype of Growth Plate Collagenopathies. J Clin Endocrinol Metab. 1 juin 2021;106(6):1742‑9. 4. Study on pathogenic genes of dwarfism disease by next-generation sequencing - PubMed [Internet]. [cité 2 sept 2021]. Disponible sur: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33728303/ 5. Update on new GH-IGF axis genetic defects - PubMed [Internet]. [cité 2 sept 2021]. Disponible sur: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31939486/ 6. Linglart A, Merzoug V, Lambert A-S, Adamsbaum C. Bone dysplasia. Ann Endocrinol. juin 2017;78(2):114‑22. 7. Baron et al. Short and tall stature: a new paradigm emerges ; Nat. Rev. Endocrinol. 11, 735–746 (2015

There is a high degree of height heritability in the literature (> 80%) which underlines the predominant role of genetic factors. Recent studies of genetic determinants by genome-wide association show that short stature could be secondary either to the association of genetic variants (polygenism) or to a single gene abnormality (monogenism). Stunted growth of genetic origin can also be aggravated by an associated nutritional disorder. Thus genetic + environmental causes can coexist. Most of these common and rare variants relate to genes involved in the development of the growth plate. Most of the genes identified in the short stature are already known in well-described monogenic diseases (genes involved in endochondral ossification or in its regulation of the GH / IGF1 axis genes). A posteriori examination of children with short stature without initial diagnosis associated with a genetic anomaly usually allows the identification of clinical or radiological abnormalities in most of them which reinforce the importance of characterizing patients properly prior to expensive investigations . Genetic diagnosis is important in order to understand the cause of the short stature, to be able to benefit from treatment with growth hormone but also to offer genetic counseling The Bicêtre Paris Saclay Endocrinology and Childhood Diabetes Department has one of the largest national cohorts of short children. We carry out daily comprehensive explorations (general, hormonal, genetic, radiological) in patients with growth retardation. The genetic explorations currently carried out are the karyotype (100% of cases), the CGH array, the search for an abnormality of the SHOX gene (FISH Karyotype +/- NGS Sequence) and FGFR3 (NGS Sequencing). We also have a panel of NGS calcium genes (Dr Bouligand, Filière Oscar) comprising the main genes known in diseases of phosphocalcic metabolism but also comprising many genes involved in growth retardation. However, the diagnostic yield remains low as described in the literature (10 to 12.5% ​​depending on the studies). Despite the targeted explorations described above (karyotype, CGH, FISH, panels targeted to the clinical findings) a certain number of patients and families of patients have unexplained growth retardation <-2 SD associated with characteristic phenotypes: IUGR, resistance to GH, growth hormone deficiency pattern, growth plate shape abnormality. The objective of our work is therefore to identify new causes of growth retardation, to validate them in vitro and to propose suitable therapeutic approaches 1. Methodology We propose to carry out this work in 3 stages: a. A Priori approach i. Database implementation • 200 patients are hospitalized per year for assessment of growth retardation. We have already identified around thirty families without a diagnosis. • Precision of the prevalence of known genes (monogenism or oligogenism) and of the genetic diagnosis of short stature within our cohort. • Declaration of the cohort to the CRB, storage and requalification of DNA samples • Constitution of the data register, request for CPP ii. Patient characterization: patient phenotype (height, weight, growth rate, nutritional status (BMI), difference between the child's height and his target height, hormonal abnormality of the GH-IGF1 axis, radiological data (Bone age , MRI looking for pituitary stem interruption syndrome, ectopic post-pituitary or pituitary hypoplasia)). Phenotype / genotype correlation. iii. Extension of the candidate gene panel b. Without A Priori approach Secondly, we propose to use the whole exome sequencing technique for patients for whom no diagnosis is found in search of new variants (monogenism or oligogenism) vs. Functional approach We plan to carry out in parallel a Project of functional characterization in vitro of the new variants identified in patients either by NGS or by exome. 2. Outlook This project aims to improve the diagnosis of growth retardation in children by increasing the rate of diagnosis of monogenic forms via the NGS approach but also by identifying individually relevant polygenic factors. The objective is also to re-evaluate the correlations between biochemical / endocrine phenotypes and genetic variants, and to re-evaluate the diagnostic approach in the face of growth retardation. The results of this study will make it possible to improve the care of these patients in order to possibly offer them treatment as well as genetic counseling. It should be noted that a child with stunted growth does not arrive in consultation on average until the age of 8 and begins treatment between the ages of 9 and 10; the delay in diagnosis is major. Our approach is therefore part of a better understanding of physiology to improve the patient journey.