Interactions génétiques–épigénétiques dans la détermination de l'organisation du génome 3D des plantes

Genetic–epigenetic interplay in the determination of plant 3D genome organization

• Auteur / Autrice : Xiaoning He
• Direction : Moussa Benhamed
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2021
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences du Végétal : du gène à l'écosystème
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : IPS2 - Institut de Sciences des Plantes de Paris-Saclay
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : IPS2
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Faculté des sciences d'Orsay

Mots clés

Mots clés libres

Ségrégation de la chromatine

Génome 3D

Régulateurs de chromatine

Tomate

Chromatin segregation

3D genome

Chromatin regulators

Tomato

Résumé

L'organisation 3D de la chromatine joue un rôle majeur dans le contrôle de l'expression des gènes. Cependant, notre compréhension des principes régissant l'organisation nucléaire reste incomplète. En particulier, la ségrégation spatiale des loci avec des états transcriptionnels répressifs similaires chez les plantes constitue un casse-tête important, mais encore mal compris. Dans cette étude, en utilisant une combinaison d'approches génétiques et de génomique 3D avancée, nous avons démontré qu'une redistribution des marques d'hétérochromatine facultative dans des régions habituellement occupées par des marques d'hétérochromatine constitutive perturbe la compartimentation du génome 3D. Cette perturbation déclenche à son tour de nouvelles interactions chromatiniques entre les régions géniques et les éléments transposables (TE). Fait intéressant, nos résultats suggèrent que les caractéristiques épigénétiques, contraintes par des facteurs génétiques, modèlent de manière complexe le paysage de l'organisation du génome 3D. Cette étude met en lumière l'interaction profonde entre les facteurs génétiques et épigénétiques qui sous-tend la régulation de l'expression des gènes au sein de la structure complexe du génome 3D. Nos résultats soulignent la complexité des relations entre les déterminants génétiques et les caractéristiques épigénétiques dans la configuration dynamique du génome 3D. CONTEXTE ET OBJECTIFS Au fil du temps, la vision traditionnelle du génome en tant que structure linéaire a évolué. Actuellement, le repliement du génome est étudié comme un processus dynamique et complexe d'organisation 3D de la chromatine au sein du noyau. Cette organisation du génome en 3D se caractérise par plusieurs niveaux hiérarchiques, allant de la chromatine aux territoires chromosomiques. Chez les eucaryotes, l'ADN est enroulé autour d'octamères d'histones formant des nucléosomes qui peuvent s'agréger entre eux, créant des grappes de nucléosomes. Ces structures se replient à nouveau pour former des domaines, avec des nanodomaines de chromatine et des domaines associés topologiquement (TADs). Ces derniers, largement décrits chez les mammifères, correspondent à des régions génomiques qui forment préférentiellement des contacts entre elles plutôt qu'avec leur environnement. La formation des TADs repose sur l'extrusion de la chromatine, permise par les complexes de cohésine, et s'arrête lorsque la chromatine se lie à deux protéines CTCF convergentes, formant alors les frontières des TADs. Cependant, ces domaines sont structurés différemment chez les plantes : les génomes des plantes n'ont pas d'homologues CTCF et l'intérieur de leurs structures semblables aux TADs contient principalement des éléments transposables (TEs) flanqués de régions actives, tandis que le modèle d'extrusion des TADs chez les animaux tend à rapprocher des séquences régulatrices distales avec les régions promotrices ou à les isoler dans l'espace des promoteurs, ce qui pourrait entrer en compétition avec la ségrégation locale des régions actives et réprimées. À une échelle plus large, les TADs s'associent pour former des compartiments spatialement séparés en fonction de leur composition. Le compartiment actif (compartiment A) correspond à la chromatine active et est associé à des marques d'histones actives, à des gènes et à une transcription active, tandis que le compartiment B représente la chromatine inactive et est défini par des caractéristiques épigénétiques répressives, allant des marques répressives d'histones à la méthylation de l'ADN et à une forte densité de TEs. Le génome présente un motif d'alternance de compartiments A et B, où les compartiments A se trouvent principalement dans les régions télomériques, tandis que les compartiments B dominent dans les régions péricentromériques chez différentes espèces de cultures. Ainsi, une ségrégation spatiale dynamique orchestre une interaction entre les régions actives et réprimées qui assure la cohérence transcriptionnelle du génome. Dans cette organisation 3D complexe du génome, une distinction apparaît entre deux types de chromatine définis comme euchromatine et hétérochromatine, qui diffèrent principalement par leur niveau de condensation et d'activité génique. L'euchromatine est moins condensée et transcriptionnellement active, tandis que l'hétérochromatine est plus compacte et répressive. Sous microscopie optique conventionnelle, l'hétérochromatine présente une structure d'ADN visuellement frappante et compactée, qui, au départ, était considérée comme constituant des régions chromosomiques inactives. Aujourd'hui, il est connu que les régions hétérochromatiques jouent un rôle fondamental dans l'organisation du génome et, par conséquent, influencent le contrôle de l'expression des gènes. L'hétérochromatine est également connue pour se diviser en deux catégories architecturales, nommées hétérochromatine facultative et constitutive. Ces deux états sont modulés par des modifications d'histones au niveau des queues N-terminales et par la présence d'autres caractéristiques épigénétiques. Ils sont largement conservés chez une grande variété d'organismes eucaryotes, bien que leurs définitions exactes puissent être remises en question par certaines exceptions parmi les organismes. De manière générale, l'hétérochromatine facultative fait référence à un état dépendant du type cellulaire, caractérisé par le passage dynamique de régions génomiques actives à inactives, ce qui, chez les plantes, est généralement associé à la tri-méthylation de la lysine 27 de l'histone H3 (H3K27me3) et régulée par les complexes répressifs Polycomb 1 et 2 (PRC1 et PRC2), jouant un rôle central dans la flexibilité de cet état. En revanche, l'hétérochromatine constitutive comprend des régions de chromatine inactive qui restent relativement constantes à travers différents types cellulaires au sein d'un organisme. Caractérisée par une faible densité génique, l'hétérochromatine constitutive est associée à la méthylation de l'ADN, servant de marqueur répressif dans la transcription, en particulier dans les TEs. Dans le modèle végétal Arabidopsis thaliana, la méthylation de novo de l'ADN est initiée par DOMAINS REARRANGED METHYLTRANSFERASE 1 (DRM1) et DRM2 sur toute cytosine dans les contextes CG, CHG et CHH (H=A, T ou C). Le maintien de cette caractéristique épigénétique implique les mécanismes de méthylation dirigée par des ARN (RdDM), comprenant les petits ARN interférents (siRNA), ainsi que l'action de diverses méthyltransférases en fonction du contexte de la cytosine. Par exemple, le maintien de la méthylation CHG implique l'action coordonnée de CHROMOMETHYLTRANSFERASE 3 (CMT3) et de plusieurs méthyltransférases d'histones H3K9 du domaine SET, notamment KRYPTONITE (KYP), responsable du dépôt de la diméthylation de la lysine 9 de l'histone H3 (H3K9me2). Ces deux enzymes se maintiennent réciproquement grâce à une boucle d'auto-renforcement, en plus du rôle reconnu de cette marque d'histone dans la répression des TEs. Au-delà de ces mécanismes, des remodelers de la chromatine comme Decreased DNA Methylation (DDM1) jouent également un rôle crucial dans la méthylation de l'ADN en permettant l'accès aux enzymes responsables de son dépôt, ciblant particulièrement les TEs, ainsi que l'ADN enroulé dans les nucléosomes. La perte de fonction de DDM1 entraîne une distribution affectée de l'hétérochromatine chez le riz, le maïs et la tomate. En effet, la tomate encode deux gènes DDM1, Slddm1a et Slddm1b, et la suppression de ces deux gènes entraîne une hypométhylation des transposons dans les régions pauvres en gènes dans les contextes de méthylation CG et CHG, ainsi qu'une hyperméthylation dans le contexte CHH. Tous ces types de chromatine distincts présentent une ségrégation spatiale au sein du noyau, avec l'euchromatine occupant le centre du noyau, l'hétérochromatine facultative qui a tendance à résider en petits regroupements à l'intérieur du noyau, et l'hétérochromatine constitutive, confinée aux régions périphériques. Cette ségrégation semble être largement conservée, car elle se retrouve à la fois chez les animaux et les plantes, et souligne le fait que certaines régions ayant le même état transcriptionnel répressif sont spatialement séparées. La raison sous-jacente à cette ségrégation spatiale des zones réprimées reste floue, soulevant des questions sur le fait de savoir si elle pourrait être associée à leurs séquences ou aux modifications d'histones spécifiques à ces régions respectives. Afin d'apporter des réponses, nous avons opté pour une approche génétique en travaillant avec le mutant ddm1 chez la tomate. Alors que l'influence de la mutation DDM1 sur l'hétérochromatine constitutive par la méthylation de l'ADN est remarquable, notre principal objectif se situe dans la redistribution de H3K27me3 des régions riches en gènes aux régions riches en TEs observée chez un mutant ddm1 chez Arabidopsis. Avec la redistribution de cette marque, ce mutant constitue une voie précieuse pour déchiffrer le rôle potentiel de l'épigénome dans l'orchestration de la ségrégation des régions réprimées du génome dans l'espace. Notre étude vise à élucider la relation complexe entre la ségrégation spatiale des régions réprimées et le paysage épigénétique sous-jacent. Par conséquent, nos résultats ont révélé une reprogrammation profonde de l'épigénome induite par la mutation DDM1, marquée par une relocalisation notable de H3K27me3 des régions riches en gènes aux régions pauvres en gènes, avec des effets conséquents sur le transcriptome. Notamment, le mutant a présenté une compartimentation perturbée, suggérant un lien entre la perturbation de l'architecture de la chromatine et la reprogrammation de l'épigénome observée. De manière intrigante, de nouvelles interactions ont émergé chez le mutant, reliant les TEs et les régions géniques, ce qui souligne l'interaction complexe entre les caractéristiques épigénétiques et l'organisation en 3D.

The 3D chromatin organisation plays a major role in the control of gene expression. However, our comprehension of the governing principles behind nuclear organisation remains incomplete. Particularly, the spatial segregation of loci with similar repressive transcriptional states in plants poses a significant yet poorly understood puzzle. In this study, employing a combination of genetics and advanced 3D genomics approaches, we demonstrated that a redistribution of facultative heterochromatin marks in regions usually occupied by constitutive heterochromatin marks disrupts the 3D genome compartmentalisation. This disturbance, in turn, triggers novel chromatin interactions between genic and transposable element (TE) regions. Interestingly, our results imply that epigenetic features, constrained by genetic factors, intricately mold the landscape of 3D genome organisation. This study sheds light on the profound genetic-epigenetic interplay that underlies the regulation of gene expression within the intricate framework of the 3D genome. Our findings highlight the complexity of the relationships between genetic determinants and epigenetic features in shaping the dynamic configuration of the 3D genome. BACKGROUND AND OBJECTIVES Over time, the traditional perspective of the genome as a linear structure has evolved. Currently, genome folding is studied as a dynamic and intricate 3D chromatin organisation process within the nucleus. This 3D genome organisation is characterised by multiple hierarchical layers, ranging from chromatin to chromosome territories. In eukaryotes, DNA is wrapped around histone octamers forming nucleosomes that can aggregate each other, creating nucleosome clutches. These structures fold again to form domains, with chromatin nanodomains and topologically associated domains (TADs). Widely described in mammals, the latter corresponds to genomic regions that preferentially form contacts with each other rather than the surroundings. TADs formation relies on chromatin extrusion, allowed by cohesin complexes, and stops when the chromatin binds to two convergent CTCF proteins, then forming TAD boundaries. However, these domains are differently structured in plants: plant genomes lack CTCF homologues and the inside of their TAD-like structures contains mostly transposable elements (TEs) flanked by active regions, while animals' TADs loop extrusion model tends to bring together distal regulatory sequences with promoter regions or isolates them in space from promoters, and could compete with the local segregation of active and repressed regions. On a larger scale, TADs associate themselves to form spatially segregated compartments according to their composition. Active compartment (A compartment) corresponds to active chromatin and is associated with active histone marks, genes and active transcription, while B compartment represents inactive chromatin and is defined by repressive epigenetic features from repressive histone marks to DNA methylation and a high density of TEs. The genome displays a pattern of alternating A and B compartments, where A compartments are mainly found in telomeric regions, while B compartments dominate in pericentromeric regions across different crop species. Therefore, a dynamic spatial segregation orchestrates an interplay between active and repressed regions which ensure the transcriptional coherence of the genome. Within this intricate 3D organisation of the genome, a distinction emerges between two types of chromatin defined as euchromatin and heterochromatin, which primarily differ in their level of condensation and gene activity. Euchromatin is less condensed and transcriptionally active, while heterochromatin is more compact and repressive. Under conventional optical microscopy, heterochromatin exhibits a visually striking and intricately compacted DNA structure, which at the beginning was thought to constitute inactive chromosomal regions. Nowadays, it has come to our knowledge that heterochromatic regions play a pivotal role in genome organisation and in consequence, influencing the control of gene expression. Heterochromatin is also known to segregate in two architectural categories, named facultative and constitutive heterochromatin. These two states are modulated by histone modifications in the N-terminal tails and the presence of other epigenetic features. They are broadly conserved among a wide range of eukaryotic organisms, although their exact definitions may be challenged by some exceptions among organisms. Overall, facultative heterochromatin refers to a cell type-dependent state characterised by dynamically switching from active to inactive genomic regions, which in plants is generally associated to histone H3 lysine 27 tri-methylation (H3K27me3) and regulated by Polycomb repressive complexes 1 and 2 (PRC1 and PRC2), playing a pivotal role in governing its flexibility. Conversely, constitutive heterochromatin comprises inactive chromatin regions that remain relatively constant across different cell types within an organism. Characterised by a low gene density, constitutive heterochromatin is associated with DNA methylation, serving as a repressive marker in transcription, particularly in TEs. In the plant model Arabidopsis thaliana, de novo DNA methylation is instigated by DOMAINS REARRANGED METHYLTRANSFERASE 1 (DRM1) and DRM2 on any cytosine in CG, CHG and CHH (H=A, T or C) context. The maintenance of this epigenetic feature involves the RNA-directed DNA methylation (RdDM) mechanisms, encompassing small interfering RNA (siRNA), alongside the action of various methyltransferases depending on the cytosine context. For instance, CHG methylation maintenance involves the coordinated action of CHROMOMETHYLTRANSFERASE 3 (CMT3) and several SET domain H3K9 histone methyltransferases, notably KRYPTONITE (KYP) responsible of the deposition of the histone H3 lysine 9 di-methylation (H3K9me2). Both of these enzymes reciprocally maintain themselves through a self-reinforcing loop, in addition to the acknowledged TEs-silencing role of this histone mark. Beyond these mechanisms, chromatin remodelers like Decreased DNA Methylation (DDM1) also play a crucial role on DNA methylation by providing access to enzymes responsible for its deposition, and particularly targets TEs, as well as DNA wrapped in nucleosomes. Loss of DDM1 function results in an affected heterochromatin distribution in rice, maize and tomato. Indeed, tomato encodes two DDM1 genes, Slddm1a and Slddm1b, and the knock-out of both of these genes leads to an hypomethylation of the gene-poor region transposons in both CG and CHG methylation contexts, and an hypermethylation in the CHH context. All of these distinct chromatin types exhibit spatial segregation within the nucleus, with euchromatin which occupies the centre of the nucleus, facultative heterochromatin which tends to reside in small gatherings within the nucleus, and constitutive heterochromatin, confined to peripheral regions. This segregation appears to be widely conserved, as it is found in both animals and plants, and underscores the fact that some regions with the same repressive transcriptional state are spatially separated. The underlying reason for this spatial segregation of repressed zones remains unclear, prompting questions about whether it could be associated with their sequences or the histone modifications specific to these respective regions. In order to provide answers, we opted for a genetic approach by working with the ddm1 mutant in tomato. While DDM1 mutation's influence on constitutive heterochromatin through DNA methylation is noteworthy, our primary focus lies in the redistribution of H3K27me3 from gene-rich regions to TEs-rich regions observed in a ddm1 mutant in Arabidopsis. With the redistribution of this mark, this mutant provides a valuable avenue for deciphering the potential role of the epigenome in orchestrating the segregation of repressed regions of the genome in space. Our study aims to elucidate the intricate relationship between spatial segregation of repressed regions and the underlying epigenetic landscape. Therefore, our results unveiled a profound reprogramming of the epigenome induced by DDM1 mutation, marked by a notable relocation of H3K27me3 from gene-rich regions to gene-poor regions, with consequential effects on the transcriptome. Notably, the mutant exhibited a disturbed compartmentalisation, suggesting a link between chromatin architecture disruption and the observed epigenome reprogramming. Intriguingly, new interactions emerged in the mutant bridging TEs and genic regions, which highlights the intricate interplay between epigenetic features and 3D organisation.